基于网络药理学及代谢组学的逍遥补肾方治疗桥本甲状腺炎的作用机制

刘婧，魏东升，安杨，孙欣，伊桐凝，张兰

（1.辽宁中医药大学研究生学院，沈阳 110847；2.沈阳市第二中医医院内分泌科，沈阳 110101；3.辽宁中医药大学附属医院内分泌科，沈阳 110032）

桥本甲状腺炎 （Hashimoto thyroiditis，HT） 是一种临床多发的自身免疫性甲状腺疾病。研究［1］显示，HT发病多与遗传易感和环境因素联合导致甲状腺免疫耐受性破坏而攻击自身有关。HT主要特征为甲状腺过氧化物酶抗体 （thyroid peroxidase antibody，TPOAb） 和甲状腺球蛋白抗体 （thyroglobulin antibody，TGAb） 阳性，临床多表现为甲状腺体积增加、淋巴细胞浸润、甲状腺组织破坏和瘢痕形成［2］。HT多从单纯甲状腺抗体升高逐渐发展为亚临床甚至甲状腺功能异常阶段，最终出现甲状腺功能减退，引发全身多系统低功能状态，甚至可能发生癌变［3］。目前，西医主要应用免疫调节剂、营养补充剂、调节甲状腺激素药物治疗HT。近年来，研究［4］证明中医药对HT具有独特而显著的疗效，不仅显著降低HT患者的甲状腺双抗体滴度，同时还在调节T淋巴细胞水平、减少炎性细胞因子分泌等多方面发挥作用，具备不良反应小、复发少等优势。

HT常与中医学的“瘿病”相关，其发病机制以肝郁气滞、痰凝、血瘀或兼脾肾亏虚为主。逍遥补肾方是本研究基于临床经验结合古方逍遥散及肾气丸加减化裁而成，是治疗HT有效的复方中药。方剂中柴胡、当归、白芍分别从疏肝气、养肝血、滋肝阴的角度助肝运行气血；党参、陈皮、白术、茯苓共同健脾，并分别从燥、化、利角度袪除痰湿水饮，助脾运化，生化气血；熟地、山茱萸、山药相配，固脱兼补肾、肝、脾之精；另佐桑葚、枸杞子滋阴养血、补肝肾益精，阴生则阳长；肾主司前后二阴，分别应用金樱子和覆盆子固精缩尿，兼顾涩肠；炙甘草调和诸药。方剂中15味中药相互作用，共同发挥疏肝、健脾、补肾的效果，降低TPOAb和TGAb水平，明显改善患者各种不适症状，有效控制HT的发展。因此，明确逍遥补肾方的潜在作用机制已成为目前研究的关键。

中药由多成分构成，其作用机制复杂。网络药理学是一门前沿学科，主要应用各种组学和网络分析技术构建和揭示药物、成分、靶点和疾病的相互联系，以阐释药物作用机制。代谢组学主要通过信息学结合高通量技术，明确各种条件下生物体内源性差异代谢物的情况。既往研究［5］发现，HT患者可能存在脂肪、多胺类、氨基酸等各种代谢紊乱。本研究基于网络药理学及代谢组学，系统分析逍遥补肾方的核心成分、靶点及差异代谢物，探讨逍遥补肾方治疗HT的可能作用机制，旨在为明确逍遥补肾方治疗HT的作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 网络药理学分析

1.1.1 逍遥补肾方中活性成分和靶点筛选：检索中药系统药理学数据库和分析平台数据库 （traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP） （https：//tcmspw.com/tcmsp.php） 中3个药物吸收、分布、代谢和排泄 （absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME）属性，包括口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18，半衰期≥4 h，获取逍遥补肾方 （15味中药） 的主要活性化合物及相关作用靶点。将获得的蛋白靶点在Uniprot蛋白数据库 （https：//www.uniprot.org/） 统一规范；将获得的DNA和RNA靶点在NCBI Gene数据库 （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/） 中标准化。

1.1.2 HT相关靶点筛选：以“Hashimoto Disease”为主题词分别在GeneCards （https：//www.genecards.org/）、OMIM （https：//omim.org/）、DisGenet （https：//www.disgenet.org/）、TTD （http：//db.idrblab.net/ttd/）、pharmGKB （https：//www.pharmgkb.org/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/） 6个数据库中检索并筛选HT相关靶点，合并去重后利用Uniprot和NCBI Gene数据库将靶点标准化。

1.1.3 逍遥补肾方-HT蛋白质-蛋白质相互作用 （protein-protein interaction，PPI） 网络构建：应用Venny2.1.0软件获得逍遥补肾方与HT的交集靶点。STRING数据库 （https：//cn.string-db.org/） 获得交集靶点的分析结果输入Cytoscape3.9.1软件，建立交集靶点PPI网络模型，选定“人类”物种，设置最小相互作用阈值>0.9。

1.1.4 核心成分及靶点筛选：应用Cytoscape3.9.1软件内置“Network Analyzer”得到有效成分及靶点的网络特征参数，包括连接度 （degree，D）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、紧密度中心性 （closeness centrality，CC），各特征参数取中位数，筛选出核心成分及靶点，构建“药物-成分-交集靶点”网络图。

1.2 实验验证

1.2.1 材料及主要仪器：SPF级SD大鼠65只，雌性，（200±20） g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司［许可证号：SYXK （辽） 2020-0001］，于辽宁中医药大学动物实验中心饲养。本研究获得医学伦理委员会批准 （21000042022049）。逍遥补肾方购自辽宁中医药大学附属医院，由柴胡6 g、当归10 g、白芍15 g等药物颗粒剂组成。质谱纯级甲酸、乙腈、甲酸铵、超纯水 （上海派森诺生物科技有限公司），Multiskan FC酶标仪 ［中国赛默飞世尔 （上海） 仪器有限公司］，Vanquish液相色谱仪、Q Exactive质谱仪 （美国Thermo公司）。

1.2.2 分组、造模及给药：大鼠适应性喂养7 d后随机分为对照组 （n= 10） 和造模组 （n= 55）。造模组按照高碘水喂养配合多次甲状腺球蛋白注射诱导构建实验性自身免疫性甲状腺炎 （experimental autoimmune thyroiditis，EAT） 大鼠模型，以TPOAb、TGAb超过对照组2倍以上为造模成功［6］。将51只造模成功大鼠随机分为模型组、硒酵母 （Se） 组、逍遥补肾 （XTK） 组，每组17只。Se组等效剂量为25.2 mg/ （kg·d），XTK组大鼠等效剂量为11.79 mg/ （kg·d），连续灌胃8周，对照组、模型组按照等体积的蒸馏水灌胃。

1.2.3 样品的采集与处理：治疗8周后大鼠禁食不禁水24 h，腹腔麻醉后腹主动脉釆血，分离血清，同时取结肠内新鲜粪便 （1～2枚），均-80 ℃冻存备用。大鼠粪便委托上海派森诺生物科技有限公司进行超高效液相色谱-串联质谱法 （ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS） 代谢组学检测，提取方法：精确称量适量样本于2 mL离心管中，加入600 μL甲醇含2-氯-L-苯丙氨酸 （4 mg/L），涡旋振荡30 s；应用组织研磨器（50 Hz） 研磨120 s；室温超声10 min；12 000 r/min 4℃离心10 min，上清液应用0.22 μm膜过滤后加入检测瓶内，用于UPLC-MS/MS检测，并从提取好的待测样本中取部分混合成质量控制 （quality control，QC）样本。

1.2.4 酶联免疫吸附实验 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 检测核心靶点：ELISA检测大鼠血清白蛋白 （albumin，ALB）、蛋白激酶B1 （protein kinase B1，AKT1） 和肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 水平，检测流程按试剂盒说明书进行。

1.2.5 ALB、AKT1和TNF-α水平的统计学分析：计量资料采用±s表示，组间比较采用单因素方差（ANOVA） 分析，P< 0.05为差异有统计学意义。

1.3 代谢组学研究

1.3.1 色谱条件：Thermo Vanquish超高效液相系统（美国Thermo Fisher Scientific公司），使用ACQUITY UPLC®HSS T3 （2.1×150 mm，1.8 μm） 色谱柱 （美国Waters公司），0.25 mL/min 流速，40 ℃柱温，进样量 2 μL。正离子模式，流动相为 0.1%甲酸乙腈 （B2）与 0.1%甲酸水 （A2），梯度洗脱：0～1 min，2%B2；1～9 min，2%～50%B2；9～12 min，50%～98%B2；12～13.5 min，98%B2；13.5～14 min，98%～2%B2；14～20 min，2%B2。负离子模式，流动相为乙腈 （B3） 与5 mmol/L甲酸铵水 （A3），梯度洗脱：0～1 min，2%B3；1～9 min，2%～50%B3；9～12 min，50%～98%B3；12～13.5 min，98%B3；13.5～14 min，98%～2%B3；14～17 min，2%B3。

1.3.2 质谱条件：Thermo Q Exactive质谱检测器 （美国Thermo Fisher Scientific公司），电喷雾离子源 （electrosprayionization，ESI），正负离子模式分别收集数据。正离子喷雾电压：3.50 kV，负离子喷雾电压：-2.50 kV，鞘气30 arb，辅助气10 arb。毛细管温度 325 ℃，分辨率70 000进行一级全扫描，一级离子扫描范围100～1 000 m/z，并采用高能碰撞 （high energy collision dissociation，HCD） 进行二级裂解，碰撞能量为30 eV，二级分辨率为17 500，采集信号前10离子进行碎裂，同时采用动态排除删除无必要的质谱/质谱（mass spectrometry/mass spectrometry，MS/MS） 信息。

1.3.3 代谢组学统计学分析：采用R软件包XCMS处理峰的检测、过滤及对齐。应用含有QC样本的LOESS信号校正方法实现数据矫正，消除系统误差。使用R软件包Ropls对样本数据进行主成分分析（principal components analysis，PCA） 及正交偏最小二乘判别分析 （orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）。P< 0.05和变量权重值（variable importance for the projection，VIP） > 1为代谢物分子差异具有统计学意义。采用MetaboAnalyst软件包对筛选差异代谢分子进行功能通路富集和拓扑学分析，并采用KEGG Mapper工具进行可视化分析。

2 结果

2.1 网络药理学分析结果

结果显示，逍遥补肾方15味中药经ADME筛选后共获得236种主要活性成分，去重后共获得201种活性成分及291个潜在标准化靶点。从GeneCards、OMIM、DisGenet、pharmGKB 4个数据库获得HT的相关靶点分别为3 365个、4 542个、335个、63个，TTD、DrugBank数据库未获得相关靶点；合并去重后共获得6 316个HT靶点。将获得的逍遥补肾方与HT相关靶点输入Venny2.1.0获得交集靶点246个。通过STRING对相互作用关系进行分析，得到交集靶点的相关数据，建立逍遥补肾方治疗HT交集靶点的PPI网络图，见图1。

图1 逍遥补肾方治疗HT的交集靶点PPI网络图Fig.1 PPI network diagram of intersecting targets of Xiaoyao tonifying kidney formula in the treatment of HT

应用NetworkAnalyzer插件计算相关参数，并经过中位数筛选获得5个逍遥补肾方治疗HT的核心靶点，包括ALB、AKT1、TNF、IL6、TP53 （表1）。构建“药物-成分-交集靶点”网络图 （图2），共获得158个成分，245个靶点，420个节点，3 461条边；筛选后获得6个核心成分，分别为槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、异鼠李素、木犀草素。其中，槲皮素的D、BC、CC值最高，推测槲皮素为逍遥补肾方治疗HT的核心成分，见表2。

表1 逍遥补肾方治疗HT的前5位核心靶点网络节点特征指数Tab.1 Top five network node characteristic indices of core targets of Xiaoyao tonifying kidney formula in treating HT

表2 逍遥补肾方治疗HT的前6个核心成分网络节点特征指数Tab.2 Top six network node characteristic indices of core components of Xiaoyao tonifying kidney formula in treating HT

图2 药物-成分-交集靶点网络图Fig.2 Network diagram of drug-component-intersection targets

2.2 各组大鼠血清ALB、AKT1和TNF-α水平比较

与对照组比较，模型组血清ALB、AKT1及TNF-α明显升高 （P< 0.01）；与模型组相比，Se组及XTK组血清ALB、AKT1及TNF-α均显著降低 （均P<0.01）；且XTK组比Se组降低更明显 （P< 0.01），见图3。

图3 各组大鼠血清中ALB、AKT1和TNF-α水平比较 （±s，n = 10）Fig.3 Levels of ALB，AKT1，and TNF-α in the serum of rats in each group （±s，n = 10）

2.3 UPLC-MS/MS数据的多元统计分析

对各组大鼠粪便进行UPLC-MS/MS代谢组学分析，PCA得分表明正常组、模型组以及XTK组QC样本聚集，说明重复性良好，结果可靠，并且各组间代谢物在一定程度上体现出了互相分离的趋势，提示逍遥补肾方能够调控EAT大鼠的代谢物，见图4。OPLS-DA结果显示正常组与模型组、模型组与XTK组彼此分离，各组组内样本相互之间聚集程度明显 （图5A）；参数均满足R2Y/Q2趋近于1，表明各组模型均无过度拟合，具有较好的解释及预测能力 （图5B）。

图4 各组PCA得分情况Fig.4 PCA score charts in each group

图5 OPLS-DA筛选差异代谢物Fig.5 OPLS-DA screening for differential metabolites

2.4 差异代谢物筛选及相关代谢通路富集

从样本一级物质列表中寻找差异代谢物，按log2FC>0或<0，P< 0.05和VIP> 1筛选出模型组与正常组、XTK组与正常组、XTK组与模型组的差异代谢物 （表3）。筛选出3组的5个共同差异性代谢物，分别为 （4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z） -二十二碳六烯酸乙酯、（S） - （+） -柠苹酸、2-酮-6-乙酰氨基己酸盐、烟酰胺、黄氧酸。与对照组比较，模型组2-酮-6-乙酰氨基己酸盐水平显著降低 （P< 0.05），而其他4个差异代谢物的水平明显升高 （均P< 0.05）。与模型组比较，XTK组 （S） - （+） -柠苹酸水平明显下降 （P<0.01），而其他共同差异代谢物的水平显著上升 （均P< 0.05），见表4。

表3 差异代谢物筛选结果Tab.3 Screening results of differential metabolites

表4 各组共同差异代谢物水平比较Tab.4 Comparison of the levels of common differential metabolites in each group

差异代谢物通路富集分析结果显示，筛选得到主要的20条代谢通路，包括苯丙氨酸代谢、味觉传导、花生四烯酸代谢、卵巢类固醇生成、酪氨酸代谢等，见图6。KEGG富集分析结果显示逍遥补肾方可能通过上调苯丙氨酸、乙酸苯酯、2-羟基苯基丙酸酯、3-羟基苯乙酸酯，下调D-苯丙氨酸、苯乙胺、水杨酸盐参与苯丙氨酸代谢 （图7）。

图6 差异代谢物通路富集分析Fig.6 Enrichment analysis of differential metabolite pathways

图7 KEGG富集通路Fig.7 KEGG enrichment pathway

3 讨论

本研究采用网络药理学及动物实验对逍遥补肾方治疗HT的核心靶点进行预测及验证。结果显示，逍遥补肾方可能通过降低ALB、AKT1及TNF-α的表达，改善HT的病情。ALB作为最丰富的甲状腺素结合蛋白，它能够联合甲状腺结合球蛋白、转甲状腺素蛋白运输甲状腺激素［7］。AKT1作为一种细胞存活途径的中枢传感器，临床研究［8］证实，HT患者甲状腺组织内AKT1水平较正常人显著升高，在细胞存活、凋亡及炎症反应的平衡之间发挥重要的作用。研究［9］显示，降低TNF-α可以抑制HT过度的免疫应答，从而改善HT的炎症损伤。本研究结果显示，逍遥补肾方含有槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等多种作用于HT的有效成分，其中，槲皮素可以抑制甲状腺细胞生长，下调钠/碘转运基因水平［10］。同时，槲皮素可下调促甲状腺激素受体、甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白基因，明显抑制放射性碘摄取［11］。山奈酚作为天然的免疫抑制剂，可以在体外有效地抑制T淋巴细胞的活化和增殖，从而减少自身免疫性疾病的发生［12］。β-谷甾醇是一种植物甾醇，具有调节免疫、抑制癌症等作用，研究［13］表明少量β-谷甾醇就可以提高体外T、NK细胞的增殖活性。

本研究结果显示，逍遥补肾方治疗HT能够使差异代谢物 （S） - （+） -柠苹酸和2-酮-6-乙酰氨基己酸盐水平降低，同时 （4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z） -二十二碳六烯酸乙酯、烟酰胺和黄氧酸的水平明显升高（均P< 0.05）。（S） - （+） -柠苹酸主要参与C5-支链二元酸代谢等多种代谢通路。2-酮-6-乙酰氨基己酸盐是赖氨酸降解的中间体，主要参与真核生物的转录激活。目前，对于 （S） - （+） -柠苹酸和2-酮-6-乙酰氨基己酸盐调节HT的研究鲜有报道，这两种差异代谢物可能成为未来逍遥补肾方治疗HT的研究重点。二十二碳六烯酸乙酯是脂质代谢产物中的脂肪酰类的一种，具有维护生物膜结构、抗自由基、广泛减弱促炎性细胞因子的抗炎作用［14］。烟酰胺又称为维生素B3，参与半胱氨酸和蛋氨酸等多种代谢途径，可以抑制微生物生长，提高细胞内NAD+的水平，抑制PARP等关键酶的活性，从而发挥调节细胞免疫反应，增强DNA修复能力等多种作用［15］。黄氧酸主要参与类胡萝卜素生物合成，足够量的类胡萝卜素可以降低多种疾病的患病风险，具有强抗氧化、抗炎、抗肿瘤等特性［16］；并且黄酮类化合物 （槲皮素与木犀草素） 与类胡萝卜素 （番茄红素、叶黄素） 能够协同预防氧化应激［17］，与本研究结果一致。本研究结果显示，XTK组 （4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z） -二十二碳六烯酸乙酯、烟酰胺和黄氧酸含量显著上升，可能是机体在逍遥补肾方的作用下启动了自身调节机制，减轻HT造成的炎症损伤，对抗氧化应激并补充自身营养，从而促进HT恢复。

代谢通路富集分析结果显示，逍遥补肾方治疗HT与苯丙氨酸代谢、味觉传导、花生四烯酸代谢、卵巢类固醇生成、酪氨酸代谢等通路关系密切。苯丙氨酸作为酪氨酸的来源之一，能够影响酪氨酸对甲状腺激素的合成［18］。甲状腺作为新陈代谢的主要调节器，患有HT等甲状腺疾病时可能会导致味觉异常［19］。花生四烯酸是人类不可缺少的一种多不饱和脂肪酸，经酶催化后会生成多种不同生物活性的类花生四烯酸，从而在炎症、细胞凋亡、氧化应激、免疫力维护中起到调节作用［20］。有研究［21］表明，HT与卵巢贮备功能减退密切相关，甲状腺功能紊乱对雌性动物生殖激素有一定影响，甲状腺素作用于卵巢颗粒细胞后，可以干扰类固醇激素的合成［22］。有研究［23］显示，酪氨酸作为甲状腺激素的合成原料之一，对甲状腺肿大的影响约占15%，高酪氨酸水平可以减轻甲状腺肿大。可见，逍遥补肾方主要通过调节甲状腺激素和卵巢类固醇合成、多种不饱和脂肪酸的生成等代谢途径改善HT。

综上所述，逍遥补肾方可以从多靶点、多成分、多代谢物、多通路对HT产生调节作用。本研究通过网络药理学结合代谢组学技术，对逍遥补肾方治疗HT的核心靶点、成分、差异代谢物、代谢通路进行了分析，探讨了逍遥补肾方治疗HT的潜在作用分子及代谢机制，为逍遥补肾方临床治疗HT提供了新的理论依据。今后将对生物作用、核心通路等进行进一步的体外、体内实验验证，以明确逍遥补肾方调节HT的具体作用机制。