定喘汤治疗呼吸道合胞病毒感染的毛细支气管炎的代谢组学研究

朱紫微，崔振泽，单玉霞，迟磊

（大连市妇女儿童医疗中心（集团） 小儿呼吸科，辽宁 大连 116000）

呼吸道合胞病毒 （respiratory syncytial virus，RSV）是导致小儿毛细支气管炎最常见的病毒［1-2］。中医学将毛细支气管炎称为“暴喘”“马牌风”，治疗以祛痰止咳、宣肺平喘为主［3］。定喘汤出自《摄生众妙方》，可用于治疗咳嗽喘息等病症［4-5］。中医学注重疾病全身的发展过程，而代谢组学可动态、系统地反映机体状态，因此，代谢组学常用于中医药疗效和机制的研究［6-7］。本研究将代谢组学应用于定喘汤治疗RSV感染的毛细支气管炎的患儿中，探讨RSV患儿与健康儿童的代谢差异以及定喘汤发挥疗效的作用机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2016年9月至2017年2月于我院接受治疗的30例RSV感染的毛细支气管炎患儿作为研究对象 （毛细组），另选取同期于我院体检的38例健康儿童作为对照组。毛细组年龄2～24个月，平均年龄（14.06±3.02） 个月，男16例，女14例；对照组年龄6～18个月，平均年龄 （13.59±2.46） 个月，男21例，女17例，2组研究对象的一般资料比较差异无统计学意义 （P> 0.05），具有可比性。本研究经我院伦理委员会审批同意。

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 毛细组患儿纳入标准：（1） 符合RSV感染毛细支气管炎的诊断标准［8］；（2） 符合中医儿科病症诊断中咳嗽喘息的诊断依据［9］，中医辨证为痰热蕴肺；（3）所有患儿均接受病毒检测确定为RSV，检测鼻咽部分泌物RSV 抗原 （+） 和 （或） 检测血清 RSV-IgM （+）；（4） 患儿监护人知晓并签署知情同意书。

1.2.2 对照组儿童纳入标准：（1） 身体健康；（2） 无喘息病史；（3） 无先天性疾病；（4） 无精神障碍。

1.2.3 排除标准：（1） 发病时间>72 h；（2） 合并先天性心脏病；（3） 存在支气管肺部发育不良；（4） 存在支气管异物；（5） 合并中枢神经系统性疾病；（6） 合并结核感染或细菌性肺炎；（7） 既往存在哮喘史。

1.3 试剂与仪器

液相色谱质谱系统 （美国Waters ACQUITY公司，器械准字：20142401651）、质谱检测仪 （美国AB Sciex公司，型号：Triple TOFTM 5600）、超纯水机 （美国Millipore公司，型号：Milli-Q，器械准字：20122450103）、乙腈 （德国Merck公司）、甲酸（美国Sigma-Aldrich公司）。

1.4 方法

1.4.1 治疗方法：毛细组患儿均接受定喘汤治疗，定喘汤配方为白果 （去壳，砸碎，炒黄） 9 g、麻黄9 g、苏子6 g、甘草3 g、款冬花9 g、杏仁6 g、桑皮9 g、黄芩6 g、制半夏9 g。无风寒外束者酌情减少麻黄剂量，痰稠难咳者原方方剂组成剂量倍黄芩。温水煎服，15～20 mL/次，2次/ d，连续治疗10 d。

1.4.2 样品采集与处理方法：采集2组患儿治疗前后的空腹静脉血5 mL，室温静置，-80 ℃冰箱保存。检测前解冻血清，离心 （8 000 r/min） 10 min，取上清100 μL，加400 μL纯水涡旋1 min，再次离心10 min，提取上清液。

1.4.3 代谢组学分析方法：

1.4.3.1 液相条件 通过液相色谱质谱系统，色谱柱（Hypersil GOLDTM，规格为50 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温60 ℃。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈，流速0.4 mL/min，进样量5 μL。梯度洗脱程序为0～0.5 min，5% B；0.5～2.5 min，5%～60% B；2.5～8 min，60%～100% B；保持2 min；0.1 min内回到初始比例5% B。

1.4.3.2 质谱条件 采用质谱检测仪，参数设置为质谱扫描范围80～1 000 m/z，碰撞电压10 V；信息采集扫描范围60～1 000 m/z，碰撞电压40 V；气帘流速30 psi，雾化流速55 psi，加热流速55 psi；离子源温度550℃，正离子喷雾电压5.5 kV；离子源温度450 ℃，负离子喷雾电压5.5 kV。

1.5 统计学分析

采用SIMCAP 11.0软件进行统计分析，建立主成分分析 （prineiple component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判别分析 （orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 2种数学模型，对其相应主成分的变量重要性 （variable importance in the proect，VIP） 进行计算，组间比较采用t检验，采用SPSS 25.0软件进行数据处理，差异性代谢物需同时满足VIP值>2、P< 0.05。

2 结果

2.1 2组代谢产物差异分析

建立OPLS-DA模型 （图1），2组分离趋势明显，说明2组的代谢产物有明显差异，响应置换检验 （图2），参数：R2Y= 0.824，Q2=0.614，说明模型有效；根据OPLS-DA模型，提取VIP > 2，同时行t检验，且满足P< 0.05，筛选差异性代谢物，分别为3个溶血磷脂酰胆碱 （lyso-phosphatidylcholine，LPC）：LPC 18∶2 sn-1、LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2，苯丙氨酸 （phenylalanine，Phe）和3个磷脂酰胆碱 （phosphatidylcholine，PC）：PC 34∶3、PC 34∶2、PC 34∶1，见图3，表1、2。

图1 健康儿童与RSV毛细支气管炎患儿的OPLS-DA得分Fig.1 OPLS-DA scores of healthy children and children with RSV bronchiolitis

图2 置换检验Fig.2 Permutation test

图3 VIP图Fig.3 VIP Chart

表1 2组差异代谢产物的相对含量Tab.1 Relative content of different metabolites between the two groups

表2 2组儿童差异代谢产物的VIP值、t值及变化趋势Tab.2 VIP values，t values，and change in the trends of differential metabolites between the two groups of children

2.2 毛细组治疗前后的代谢组学变化

建立OPLS-DA模型图 （图4），2组分离趋势明显，说明2组的代谢产物有明显差异；置换检验 （图5） 参数显示，R2Y= 0.742，Q2=0.580，说明模型有效；提取VIP > 2且P< 0.05的变量，筛选差异性代谢物，分别为3个LPC （LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2、LPC 16∶0 sn-1），Phe，PC 34∶2，SM34∶1，去甲-戊二酰胺，见图6，表3、4。

图4 RSV毛细支气管炎患儿治疗前后OPLS-DA得分图Fig.4 OPLS-DA score map of children with RSV bronchiolitis before and after treatment

图5 RSV毛细支气管炎患儿治疗前后的置换检验Fig.5 Permutation test of children with RSV bronchiolitis before and after treatment

图6 基于OPLS-DA分析的VIP图Fig.6 VIP chart based on OPLS-DA analysis

表3 RSV毛细支气管炎患儿治疗前后差异代谢产物的相对含量Tab.3 Relative content of differential metabolites in children with RSV bronchiolitis before and after treatment

表4 RSV毛细支气管炎患儿治疗前后差异代谢产物的VIP值、t值及变化趋势Tab.4 VIP values，t-values，and change in the trends of differential metabolites in children with RSV bronchiolitis before and after treatment

2.3 代谢产物的动态变化

结合上述健康儿童、RSV感染毛细支气管炎经定喘汤治疗前后的代谢产物的变化，发现LPC 18∶0 sn-1、LPC 18 ∶0 sn-2、LPC 18 ∶2 sn-1、PC 34 ∶3、PC 34∶2、PC 34∶1、LPC 16∶0 sn-2可反映患儿从健康到发病再到治疗后好转的折线变化趋势，其中变化最明显的为LPC 18∶0 sn-1以及LPC 18∶0 sn-2，见表5。

3 讨论

本研究对比正常组和毛细组的代谢指标，结果显示，毛细组患儿表现为LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2的升高以及LPC 18∶2 sn-1、Phe、PC 34∶3、PC 34∶2、PC 34∶1的降低，表明RSV感染后主要影响患儿的脂肪代谢。该病在中医上属外感热证范畴，研究［10］显示，脂肪代谢与热证相关，因此患儿感染RSV后会出现脂肪代谢紊乱。LPC是氧化损伤低密度脂蛋白的主要成分，主要诱发炎症反应［11］。PC具有乳化功能，可将胆固醇和脂肪酸化为微粒，使之排出，同时可防御病毒［12］。研究［13-14］发现，磷脂代谢紊乱及氨基酸代谢紊乱均为免疫功能下降，RSV感染后均有体现。

定喘汤主治痰热内蕴、肺气上逆，本研究中毛细组均予定喘汤治疗，对比其治疗前后共筛选出7个差异代谢物，包括LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2、LPC 16∶0 sn-1、Phe、PC 34∶2、SM34∶1以及去甲-戊二酰胺。Phe可在肠道中分解代谢，因此RSV感染后会使肠道菌群紊乱，影响免疫功能［15］。鞘磷脂主要可引起过敏及炎症反应，还可抑制病毒的释放。定喘汤中以桑白皮为君药，其所含的酸性物质影响血小板中环氧合酶的活性，减少炎症反应，还能增强免疫系统的调控，因此定喘汤治疗后，Phe、SM34∶1水平上升。LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2、LPC 16∶0 sn-1为脂代谢的相关产物，经治疗后均明显下降，中医中认为甘草可调和脾胃，调节脂代谢紊乱，款冬花、制半夏等药物具有消炎杀菌的作用，均可达到抗病毒、增强免疫力等功效。

综上所述，RSV感染后脂代谢紊乱最为明显，LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2的水平经定喘汤治疗后变化最大，考虑与定喘汤通过改善脂代谢水平、增强抵抗力，以此促进疾病的恢复有关。本研究中代谢组学分析模型均稳定且可靠，证实选取的差异性代谢物较好。但本研究选取的样本量较小，后期需进行多中心的大样本研究，进一步验证本研究结论。