子宫内膜NK细胞在胚胎种植中的研究进展

黎俏 综述 高天旸 审校

1.南方医科大学第二临床医学院，广东 广州 510515；2.东莞康华医院生殖医学中心，广东 东莞 523080；3.广东省第二人民医院生殖医学中心，广东 广州 518025

最新证据表明，免疫系统在生殖相关疾病的发生发展中起重要作用[1]。子宫自然杀伤细胞(uNK)是天然免疫调节中的一种淋巴细胞亚群，是妊娠后母胎界面中重要的免疫细胞。早期人类对uNK 细胞在生殖系统的作用可能存在一些错误的认识，主要是基于对外周血自然杀伤(pbNK)细胞的相关研究，认为uNK细胞也有类似pbNK 的毒性作用，对生殖过程有不良影响。但越来越多的证据显示，uNK 细胞和pbNK 细胞具有不同表型和功能特征，uNK在生殖过程中扮演有益的角色，是实现胚胎植入、维持妊娠的基础保障。妊娠是一个免疫过程，因为两个基因不同的个体并存。母体淋巴细胞里的T 细胞和大量独特的uNK 细胞可以识别子宫母胎界面的胎盘细胞，存在多种避免T细胞损伤胎儿的保护机制，从而猜测uNK细胞的激活可能是生理性的，uNK细胞对胎盘细胞的同种异体识别成为调节胎盘功能的关键母婴免疫机制。近年研究表明，uNK细胞与胚胎种植和早期胎盘功能等密切相关，其维持着胎儿和母体间的平衡，一旦失去平衡，就会导致反复着床失败或复发性流产等妊娠相关疾病[2]。随后广泛的研究表明了uNK细胞在妊娠期间的各种作用，包括新血管的形成、滋养细胞的迁移和免疫耐受等。然而，目前还不清楚uNK细胞在正常和病理性妊娠中的具体功能，所以须谨慎对待任何抑制NK细胞的疗法。本文就uNK细胞在胚胎种植过程中发挥作用的研究进展做一综述。

1 母胎界面发育

母胎界面是子宫黏膜和胚胎的胚外组织的连接交界处，其作为两个同种异体之间交流的平台。滋养层细胞的侵入启动母胎屏障的形成，这些滋养层细胞来源于胚胎的囊胚层以及子宫内膜。在人类胚胎发育过程中，滋养层细胞分化为两个亚群：绒毛滋养层(VTs)和绒毛外滋养层细胞(EVTs)。EVTs侵入血管内壁，重建螺旋动脉，而VTs形成绒毛膜绒毛，绒毛膜绒毛位于绒毛的表面，具有向胎儿运输营养和氧气的能力[3]。滋养细胞是胚胎外组织中最常见的细胞类型，它们帮助在胎盘一侧形成叶状绒毛膜和底蜕膜以及在另一侧形成绒毛膜羊膜。子宫内膜通过蜕膜化的特殊组织反应来帮助胚胎及胎盘的发育和功能。蜕膜化是母胎关系发展的重要过程。其特征是黏膜基质细胞(ESCs)增殖分化为具有丰富细胞质的大块球形细胞，以及蜕膜基质细胞的核和表型变化。随着胚胎的扩张和细胞滋养层细胞的侵入生长，子宫内膜布满螺旋动脉的蜕膜。子宫腺体、基质细胞和免疫细胞共同作用以实现蜕膜化。胚胎发育的最重要条件之一是子宫内膜蜕膜化。妊娠早期蜕膜化伴随免疫细胞的增加，其占总蜕膜细胞的40%，这些细胞同时对子宫腺体及胎盘组织有营养作用。缺乏蜕膜化可能会导致其他一些妊娠相关的疾病[4]，如不孕症、复发性自然流产(RSA)、胎儿子宫内生长受限(IUGR)等。

2 NK细胞

2.1 NK细胞发育的细胞阶段 免疫学家一直被母亲和胎儿之间的联系所吸引。Fukui 等[5]在1953 年首次描述了半异基因胎儿的存活情况，以此来说明母亲对胎儿的免疫耐受性。近年来，主动免疫的概念得到了普及，支持植入部位的免疫系统不受抑制的观点，说明它是功能性的。最近的研究结果表明，胎儿细胞和母亲的免疫细胞包括先天淋巴细胞(ILC)、T调节细胞、巨噬细胞等，它们可进行双向免疫对话[6]。在人类中，NK 细胞是一种高度特化的大颗粒淋巴细胞亚群，约占全部循环淋巴细胞的15%[7]。它们是大型细胞毒性先天淋巴细胞，可在免疫学上调节白细胞活化和实现微生物感染监测。由于它们具有将病毒感染和癌细胞与健康细胞区分开来的潜力，无需预先致敏，因此被称为“天然”杀手。IFN-γ和TNF-α是NK细胞分泌的两种炎症介质，它们介导细胞毒性并产生大量炎症细胞因子[8]。NK 细胞存在于骨髓、肝脏、子宫、脾脏和肺中，也有少量发现在次级淋巴组织(SLT)、黏膜相关淋巴组织(MALT)和胸腺中[9]。与其他血细胞一样，NK 细胞起源于骨髓来源的多能祖细胞，即CD34+造血干细胞(HSC)。人类NK 细胞的发育通过由各种细胞表面标志物受体的存在定义为多阶段的分化过程，共分为五个阶段[10]：第一阶段，CD34+CD117+CD123+/+FLT3+；第二阶段，CD34+CD117+CD123+FLT3+CD127+；第三阶段，CD38+CD117+CD123+CD45+CD7+CD10+CD127+；第四阶段，CD34+CD117+/+CD94+CD16+(也称为CD56bright)；第五阶段，CD34-CD117-/+CD94+CD16+(也称为CD56dim)。CD56+CD16+和CD56-CD16+是基于CD16 表达的人类常见NK细胞的两个亚群[11]。CD56+NK细胞群产生大量的IFN-γ，并随着细胞因子IL-2、IL-12、IL-15或IL-18的增加而增殖，但它对靶细胞识别没有反应并且具有低杀伤力。另一方面，CD56 缺陷型(CD56+)NK细胞大多具有细胞毒性，并且产生较少的IFN-γ。最近发现了一部分新的NK 细胞，即CD56-CD16-的NK 细胞亚群，其表面受体谱介于CD56+的和CD56-之间，能产生IFN-γ和细胞毒性[12]。

2.2 uNK细胞的起源 长期以来，研究人员一直好奇于妊娠期间uNK 细胞的起源。根据一项动物研究，子宫中NK细胞的形成和成熟与其他组织中的NK细胞发育具有一些共同特征，同时也表现出组织特异性，因此它们有利于塑造母胎界面发育过程中发生的结构变化[13]。也有人提出，免疫过程通过复杂的信号通路为uNK细胞活化、增殖和分化建立了一个平衡的环境[14]。曾有报道在小鼠处女子宫中，外周循环中的CD49a-DX5+cNK 细胞很少，但却存在大量的CD49a+DX5+trNK细胞[15]。这些trNK细胞不同于肝脏和皮肤组织中发现的其他trNK 细胞，因为它们缺乏T-bet 转录因子的表达，并被识别为NK细胞的独特谱。此外，在妊娠小鼠较处女小鼠子宫中发现高比例的trNK 细胞，表明其可能通过妊娠期间的局部增殖，同时trNK细胞可能有助于uNK 细胞的积累。此外，通过实验诱导蜕膜化的试验证实，在早期妊娠模型中，在trNK细胞局部增殖时，迁移的循环NK(cNK)细胞贡献较少[16]。相反，Sojka等[14-15]2018年收集的数据并没有真正忽略cNK细胞的贡献，因为它们的数量也是从外周循环血积累的。因此作者提出了一个两波假设[16]，以支持cNK细胞和trNK细胞在怀孕期间有利于对uNK细胞积累。第一波为在子宫内膜重塑期间蜕膜化过程中开始。根据研究结果，这种波是由局部trNK细胞增殖引起的，cNK细胞对妊娠早期uNK细胞池的增长贡献最小。第二波在形成胎盘过程中参与的cNK 细胞，包括血管重塑。缺乏cNK细胞但保留trNK细胞的小鼠，如Nfil3小鼠，在uNK细胞积累方面表现出显著缺陷，胎盘不理想，螺旋动脉重塑异常。总的来说，这些发现表明trNK 细胞和外周循环血cNK 细胞都是在妊娠期间的uNK细胞汇集中发挥作用的。

2.3 uNK 细胞的功能 uNK 细胞在月经周期呈周期性表达特点，在妊娠后母胎界面表达显著升高，受到甾体激素的精细调节。uNK 细胞通过其表达的受体与EVTs上配体相互作用，在维持免疫耐受、实现螺旋动脉重塑、控制滋养层侵袭和促进胎盘发育中发挥关键作用[17]。uNK 细胞表达许多受体，包括杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)等，EVTs 表达I类HLA-C/E/G/F的MHC分子，具有高度多态性。KIR/HLA-C的不同组合与复发性流产、先兆子痫和胎儿生长受限等相关，影响妊娠结局。

3 反复着床失败中的NK细胞的功能

当有证据表明没有发生植入时，通常被诊断为植入失败[18]。目前对于反复着床失败(repeated/recurrent implantation failure，RIF)的定义诊断标准尚未统一，目前国内外较为公认的RIF 定义是：经历3 次及以上移植周期，且累积移植至少4 枚卵裂期优质胚胎而未获临床妊娠[19]。IVF/ICSI-ET周期中胚胎着床率约30%，反复着床失败的发生率为5%～10%[20]。有研究表明RIF 经常由有功能缺陷的子宫内膜引起，约25%的RIF 患者种植窗发生置换，因此uNK 细胞在植入期的预测中起着重要作用，这表明它们可能导致胚胎植入失败[21]。曾有研究报告显示，与正常可生育妇女组相比，有不明原因的反复植入失败史的妇女在妊娠前子宫内膜中存在更多数量的uNK细胞，从而推测uNK可能参与RIF[22]。此外，在分泌中期，与正常生育女性组对照相比，IVF 后患有RIF 的女性显示出uNK 细胞在基质细胞中的比例显著增加，同时显示uNK细胞数量与IL-15 的基质表达相关。同样，一项队列研究发现，患有RIF 的女性子宫内膜IL-12 或IL-18 水平较高，这可能与较高的uNK细胞数量有关[23]。另外一项研究发现，与IVF后胚胎着床的女性相比，RIF 女性的uNK 细胞与子宫内膜小动脉的数量和分布没有显著差异[24]。在一项系统分析中，将患有RIF 的女性与对照组进行比较，发现子宫内膜中pNK 或uNK 细胞没有差异[25]。综上，目前各种研究的结果参差不齐，尽管在临床研究中广泛使用了各种细胞计数测量，但目前还没有确凿的证据表明uNK 细胞参与了妊娠病理。因此在RIF环境中检测pbNK或uNK细胞需要进一步研究。

4 妊娠并发症治疗的免疫调节策略

正常的妊娠过程是母体免疫系统和胎儿抗原共同作用的结果，该免疫系统适应失败可导致母胎发生同种免疫排斥反应，导致各种妊娠的相关并发症。为了积极改变母体免疫系统或减少过度的免疫反应所产生的破坏，临床上常用免疫调节药物用于治疗妊娠相关并发症，如糖皮质激素、静脉注射免疫球蛋白(IVIG)和抗TNFα药物等。先前的研究表明，适当的dNK(定位于基底蜕膜的uNK 细胞)细胞生理性能可确保健康怀孕，但降低dNK 细胞功能会导致妊娠失败[26]。尽管dNK 细胞功能障碍的实际病因尚不清楚，但维持NK 细胞的正确激活状态对于每次正常妊娠都至关重要，因此，其在抑制NK 细胞功能的治疗中可能会增加风险。

自从发现NK 细胞代表着床和妊娠早期子宫内膜基质的关键白细胞成分以来，临床已经对NK 细胞进行了很多研究。尽管在了解NK细胞的作用方面取得了重大进展，但人体组织的可用性和从动物模型推断的局限性限制了临床对妊娠早期阶段的研究。uNK细胞的功能研究揭示了它们的功能，特别强调细胞因子和血管生成生长因子的释放，以及妊娠早期的螺旋动脉重塑。研究表明NK 细胞计数在反复种植失败患者中发生了改变，但其功能影响尚不清楚。在发现有效的诊断和治疗方法之前，了解uNK 细胞数量增加的机制以及功能后果至关重要。此外，在未来的研究中，应研究男性变量(如精液成分)对uNK 细胞分化和反复着床失败的可能影响。此外，了解子宫中不同细胞类型之间的串扰环境是有限的，未来的研究还应该阐明这些相互作用在各种生理和病理情况下的复杂性。

5 展望

uNK 细胞在水平上的研究仍存在技术上的局限性，因此仍有很多未知值得进一步探索，特别是关于uNK 细胞的确切起源和功能。复杂性是生殖免疫相关研究的主要特点，主要表现为参与分子的多样性、效应作用水平的差异性(分子、细胞、组织水平等)，以及遗传组合的多态性。未来利用新的分子和遗传学方法进行研究有助于确定uNK 细胞与母胎界面其他细胞的相互作用机制，并在未来实现临床转化应用。基于既往pbNK 细胞的相关研究，目前临床针对反复种植失败(RIF)和复发性流产(RM)已开展不同的免疫治疗方法，包括：父系淋巴细胞主动免疫、类固醇、TNFa 抑制剂、静脉输注免疫球蛋白(IVIG)、脂肪乳以及宫腔灌注重组人粒细胞集落刺激因子(r-GSF)等，用于治疗uNK 细胞的“过度”免疫反应。但研究结果存在很大争议，一些方法已逐渐被停用。此外，现有研究大多集中在寻找外周血中的标志物pbNK，并不直接针对uNK 细胞，对疗法缺乏业内共识，研究设计存在很大局限性。未来需要更多设计良好、样本量更大的前瞻性随机对照研究，以便更客观、更完整地评估相关免疫疗法的疗效、可靠性，特别是关注这些治疗方法的安全性。因此，对于相关“免疫疗法”的临床应用，仍应该保持谨慎的态度。