黄芪-山楂对多囊卵巢综合征大鼠卵巢生殖功能的影响及炎性作用机制

田秀秀，李美霖，龚宇航，马希雅，张雪娟

（1.山西中医药大学，山西 太原 030024；2.山西医科大学公共卫生学院，山西 太原 030000；3.山西省儿童医院，山西 太原030013）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是女性常见的一种代谢内分泌紊乱及生殖障碍性疾病，目前发病率约6%，以雄激素过多、排卵不规律和多囊卵巢为主要表现，也表现为2 型糖尿病、胰岛素抵抗及心血管疾病等一系列代谢并发症问题［1-3］。该病发病机制并未完全阐明，发病时间早至青春期，甚至伴随终身，目前尚无法治愈，严重影响育龄期女性的身心健康［4］。现代研究表明 PCOS 患者存在排卵功能障碍，具有受孕率低流产率高的特点，成为诱发育龄期女性不孕最重要的原因，尽早采取措施进行干预治疗对于改善PCOS 患者的生殖功能具有重要意义，目前中医药在防治PCOS 疾病的发生及发展方面具有独特优势［5］。中药黄芪始载于《神农本草经》，现代药理学研究发现，黄芪中的活性成分槲皮素可以改善炎症微环境［6］。动物实验研究表明其能发挥对卵巢组织中抗氧化基因表达的调控作用，进一步有效提升卵巢衰老小鼠的生殖能力［7］。中药山楂主要成分为黄酮类、有机酸类等，具有抗炎、降糖、降脂等多种药理作用［8］。因此本实验拟通过高脂饲料喂养建立PCOS 大鼠模型，探讨黄芪-山楂预防给药对PCOS 大鼠卵巢生殖功能的影响及炎性作用机制，为PCOS 的临床药物防治提供实验参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 50 只21 日龄SPF 级SD 大 鼠，雌性，实验动物生产合格证号：SCXK（京）2019-0010，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，饲养于山西省中医药研究院实验中心。实验动物房室内温度保持在（28±1.5）℃，室内湿度保持在（40±5）%，室内环境通风，昼夜明暗交替（12-12 h），饮食饮水自由，适应性喂养1 周后开始实验。实验过程遵循动物伦理，本次动物实验伦理审批号：NO.201911048。

1.1.2 饲料 动物普通饲料能量成分：脂肪12.11 %、蛋白22.47 %、碳水65.42 %，来自于华阜康大小鼠维持饲料（1022）；动物高脂饲料能量成分：脂肪60 %、蛋白20 %、碳水20 %，来自于派克生物（M10160）。

1.1.3 药物 黄芪配方颗粒（规格1 g=10 g 饮片，药品批号：2006003c，三九医药有限公司），山楂配方颗粒（规格1 g=6.7 g 饮片，药品批号：1906002s，三九医药有限公司）。

1.1.4 试剂及仪器 大鼠黄体生成素（LH） 、卵泡刺 激 素（FSH）、睾 酮- α（T）、肿 瘤 坏 死 因 子（TNF-α）、白介素（IL）-6、IL-17A、IL-10 酶联免疫分析ELISA 试剂盒（批号依次为：ML064293、ML059034、ML024321、M1022281、M1037365、M1003298、M1002894），上海酶联生物科技有限公司；水合氯醛溶液、亚甲基蓝、0.9%生理盐水（批号依次为：10003460、100023444、10002734），国药集团化学试剂有限公司；HE 染色套装（批号：G1003），Servicebio；酶标仪（RT-6100，450 nm 波长），Rayto；载 玻 片（G6004），Servicebio；病 理 切 片 机（RM2016），上海徕卡仪器有限公司；台式高速冷冻离心机（型号：TGL16M），上海卢湘仪仪器有限公司；脱水机（Donatello），DIAPATH；电子显微镜，日本尼康。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、造模及给药 选取50 只21 日龄SPF 级SD 大鼠，雌性，按照随机数字表法对50 只大鼠按10 只一组进行分组，分为5 组，分别为正常组、模型组、黄芪组、山楂组和黄芪-山楂对药组。正常组大鼠喂食普通动物饲料，模型组及各给药组大鼠喂食高脂动物饲料，持续15 周建立高脂诱导型PCOS 大鼠模型。期间正常组、模型组大鼠给予蒸馏水，各给药组中黄芪、山楂、黄芪-山楂水溶液分别按黄芪0.6 g/mL，山楂0.3 g/mL，黄芪-山楂（3∶1）0.6 mL/g 配制浓度进行配制，各给药组大鼠分别按黄芪0.3 g/kg、山楂0.97 g/kg（参考大鼠及成年女性的体表面积换算给药及预实验药效结果而得）进行干预性灌胃给药。以大鼠血清中雄激素水平升高和动情周期出现紊乱无排卵来作为PCOS 模型大鼠造模成功的指标［9］。

1.2.2 各组大鼠的动情周期 从造模的第8 周开始，每天8∶00 对各组大鼠进行连续3 个动情周期的阴道涂片检查。研究证实正常大鼠一个完整的动情周期（动情前期、动情期、动情后期和动情间期）持续时长大致为4～5 d［10］。如果时长≥6 d，周期杂乱，或出现某一时期的长期停留，则认为大鼠存在动情周期紊乱［11］。将各组中每只大鼠出现的动情周期时长记录下来并进行汇总，按每组紊乱大鼠数（只）/每组大鼠总数（只）×100%来计算各组大鼠的动情周期紊乱率。

1.2.3 样本采集 15 周后每个组的大鼠禁食12 h，用10 %的水合氯醛溶液实施腹腔麻醉，从下腔静脉取血。将抽取到的血清样本放置2 h 后，放入3 000 r/min 的离心机中，进行离心15 min 后，取上层血清。立即将大鼠处死，迅速解剖，剥离脂肪组织，将一侧卵巢组织分离出来后放入4%的多聚甲醛溶液中进行固定，-80 ℃保存待用，以备后续观察。

1.2.4 各组大鼠的卵巢组织 将放入4%多聚甲醛溶液的左侧卵巢进行固定，使用切片机进行切片处理石蜡包埋的卵巢组织，垂直风干，脱蜡，再水化，伊红-苏木素（ HE） 染色后封片，于显微镜下对大鼠卵巢组织载玻片进行拍照观察。

1.2.5 各组大鼠血清性激素相关指标的测定 用ELISA 试剂盒对下腔静脉取到的血清样本进行检测，测定各组大鼠血清中 FSH、 LH、T 的水平，计算LH/FSH 的比值。

1.2.6 各组大鼠血清炎症相关因子相关指标的测定 用ELISA 试剂盒对下腔静脉取到的血清样本进行检测，测定各组大鼠血清中促炎细胞因子IL-6、IL-17A、TNF-α 及 抗 炎 细 胞 因 子IL-10 的水平。

1.2.7 统计学方法 采用软件SPSS 25.0 对各项数据进行统计学分析。采用百分率（%）表示计数资料，组间比较使用χ2检验，如果超过20%的T ＜ 5或至少1 个T ＜1 ，则用Fisher 确切概率法。均数±标准差（±s）表示计量资料，多组间比较使用ANOVA 单因素方差分析，两两之间进行比较使用LSD 检验。P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠动情周期变化

与正常组相比，模型组大鼠出现动情周期紊乱的占比显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，黄芪-山楂组大鼠出现动情周期紊乱的占比显著降低（P＜0.01）。黄芪组与山楂组、黄芪-山楂组之间无显著性差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠动情周期紊乱率（n=10）Tab 1 Disturbance rate of estrous cycle of rats in each group （n=10）

2.2 各组大鼠卵巢组织形态变化

正常组大鼠卵巢横截面显示规则的组织学形态，颗粒细胞层致密，出现丰富的黄体和健康的卵泡，闭锁和囊性卵泡数量较少。模型组中观察到较少数量的黄体和具有许多滤泡卵巢囊肿的窦卵泡，卵巢明显呈囊性改变。与模型组相比，各给药组大鼠卵泡发育良好，数量丰富，颗粒细胞层数增多，囊性卵泡数减少，成熟卵泡数增加和黄体数增加；其中黄芪-山楂组大鼠可见卵巢组织中囊性卵泡数减少明显，成熟卵泡数及黄体数增多显著，黄芪组和山楂组相对于黄芪山楂联合给药组对大鼠卵巢组织囊性的改善效果稍差。见图1。

图1 各组大鼠卵巢组织形态（H＆E×40）Fig 1 Ovarian tissue morphology of rats in each group （H＆E×40）

2.3 各组大鼠血清LH/FSH、T 水平变化

与正常组相比，模型组大鼠LH/FSH、T 水平显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，黄芪组、山楂组、黄芪-山楂组大鼠LH/FSH、T 水平显著降低（P＜0.05）。与黄芪组、山楂组相比，黄芪-山楂组T 水平显著降低（P＜0.05）；黄芪组与山楂组、黄芪-山楂组之间LH/FSH 水平无显著性差异（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清LH/FSH、T 水平变化（n=10，±s）Tab 2 Changes of serum LH/FSH and T levels in each group（n=10，±s）

表2 各组大鼠血清LH/FSH、T 水平变化（n=10，±s）Tab 2 Changes of serum LH/FSH and T levels in each group（n=10，±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，与模型组比较，#P＜0.05，与黄芪组比较，ΔP＜0.05，与山楂组比较，▲P＜0.05。

LH/FSH 0.77±0.03 2.02±0.09*1.25±0.16#1.41±0.07#1.15±0.16#11.256＜0.001组别正常组模型组黄芪组山楂组黄芪-山楂组T(ng/dL)16.11±0.74 18.45±0.35*14.21±0.27#15.05±1.36#FP 12.30±0.39#Δ▲7.225 0.003

2.4 各组大鼠血清IL-6、IL-17A、TNF-α水平变化

与正常组相比，模型组大鼠IL-6，IL-17A、TNF-α 水平显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，黄芪组、山楂组、黄芪-山楂组大鼠IL-6、IL-17A 水平显著降低（P＜0.05）；黄芪组、黄芪-山楂组大鼠TNF-α 水平显著降低（P＜0.05）。与黄芪组相比，山楂组、黄芪山楂组大鼠IL-6、IL-17A、TNF-α 水平无显著性差异（P＞0.05）。与山楂组相比，黄芪-山楂 组 大 鼠IL-17A 水 平 显 著 降 低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清IL-6、IL-17A、TNF-α 水平变化（n=10，±s，pg/mL）Tab 3 Changes of serum levels of IL-6， IL-17A and TNF-α in each group（n=10，±s，pg/mL）

表3 各组大鼠血清IL-6、IL-17A、TNF-α 水平变化（n=10，±s，pg/mL）Tab 3 Changes of serum levels of IL-6， IL-17A and TNF-α in each group（n=10，±s，pg/mL）

注：与正常组比较，*P＜0.05，与模型组比较，#P＜0.05，与山楂组比较，▲P＜0.05。

组别IL-6 IL-17A TNF-α正常组模型组黄芪组山楂组黄芪-山楂组13.67±2.85 27.21±0.85*18.71±1.69#19.79±0.53#16.39±2.07#▲137.51±21.95 206.56±26.58*172.73±17.46#179.07±27.23 153.90±22.97#82.03±7.83 116.84±9.78*94.43±11.40#102.33±9.63#92.27±7.98#11.38 0.001 7.438＜0.001 FP 23.707＜0.001

2.5 各组大鼠血清IL-10 水平变化

与正常组相比，模型组大鼠IL-10 水平显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，山楂组、黄芪-山楂组大鼠IL-10 水平显著升高（P＜0.05）。与黄芪组相比，黄芪-山楂组大鼠IL-10 显著升高（P＜0.05）。与山楂组相比，黄芪组和黄芪山楂组大鼠IL-10 无显著性差异（P＞0.05）。见表4。

表4 各组大鼠血清IL-10 水平变化（n=10，±s）Tab 4 Changes of serum IL-10 level in each group（n=10，±s）

表4 各组大鼠血清IL-10 水平变化（n=10，±s）Tab 4 Changes of serum IL-10 level in each group（n=10，±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，与模型组比较，#P＜0.05，与黄芪组比较，ΔP＜0.05。

IL-10 (pg/mL)53.77±2.07 31.45±3.72*41.64±3.39 43.96±2.20#47.87±3.01#Δ 23.442＜0.001组别正常组模型组黄芪组山楂组黄芪-山楂组FP

3 讨论

PCOS 病名的记载未出现于中医医学典籍中，但其与“不孕”“月经过少”等疾病的临床表现相似，将PCOS 疾病的产生归于“肾-天癸-冲任-胞宫”生殖轴的功能失常，认为该病的病因病机为本虚标实，以肾虚、脾虚的脏腑虚损为主，夹杂着痰湿、血瘀等实性病理产物［12］。肥人平素饮食不节，喜食肥甘厚腻之品，日久损伤脾气，气虚多生痰脂，正如《医境》云：“肥人多湿，其痰易结，亦有因湿而血滞者”。《胎产指南》中记载“挟痰者，痰涎凝滞，……为经闭，为无子之病”。脾为先天之本，可运化水湿，脾气亏虚则运化不利，湿聚成痰，痰湿不化，气血运行受阻，阻滞于冲任、胞宫，影响肾精的化生、濡养，进而导致经水失调，难以种精受孕［13］。因此本研究选用中药黄芪、山楂预防给药，通过发挥健脾益气，破瘀化痰的功效来治疗PCOS，体现“治未病”思想。中医认为脾气以升为健，应用中药黄芪甘温，善入脾肺，补益脾肺之气，养血行滞［14］。中药山楂酸甘温，醒脾消食，破瘀化痰［15］。两药联合应用发挥补泻兼施之效，达到标本兼治之功。

多囊卵巢综合征是育龄期妇女常见的一种内分泌代谢疾病，同时也是一种生殖障碍性疾病，严重影响女性的生殖健康，是目前研究卵巢生殖功能的前沿热点［16］。随着对PCOS 疾病的深入研究，越来越多的学者认识到PCOS 处于一种低度慢性炎症状态，炎性细胞因子之间相互作用，在管理卵巢生殖功能方面起着重要作用［17］。PCOS 中存在着高表达的炎症因子，调节卵巢正常活动的卵泡期和黄体期，加重了高雄激素血症，加速了卵泡的凋亡［5，18］。大量研究表明，炎症细胞因子的表达异常造成免疫功能的紊乱或免疫相关因子的失调，能导致PCOS的发生，可直接影响卵泡发育或排卵障碍，导致生殖功能的低下，甚至不孕［19］。因此本实验通过测定大鼠炎症相关因子水平的变化来探讨对PCOS 大鼠卵巢生殖功能的作用。

此次实验中模型组出现动情周期紊乱的大鼠数量增加，紊乱率明显升高，卵巢组织发生囊性改变，镜下可见较少数量的黄体和具有许多滤泡卵巢囊肿的窦卵泡，性激素LH/FSH、T 水平显著升高，表明高脂诱导型PCOS 大鼠确实存在卵巢生殖功能的紊乱。与景彦林等［20］得出的雌性生育大鼠在高脂饮食诱导下出现卵泡的囊肿发育，干扰排卵，进而影响到大鼠生殖功能的研究结论相一致。采用黄芪、山楂、黄芪-山楂水溶液分别对大鼠进行干预性灌胃给药后，发现各给药组出现动情周期紊乱的大鼠数量减少，紊乱率明显降低，卵巢组织中囊性卵泡数减少，成熟卵泡数及黄体数增多，性激素LH/FSH、T 水平明显降低，其中黄芪-山楂组中成熟卵泡和黄体数增多效果更明显，T 水平比单独给药组降低更显著（P＜0.05），提示黄芪、山楂预防给药均可以改善PCOS 大鼠的卵巢生殖功能，但黄芪、山楂联合用药的改善效果更为突出。

许多研究表明PCOS 与卵巢生殖功能和全身的慢性低度炎症之间存在紧密的联系［21］。该实验中PCOS 模 型 大 鼠 的 促 炎 因 子IL-6、IL-17A、TNF-α水平明显上升，抗炎因子IL-10 水平明显降低（P＜0.05），表明该PCOS 模型大鼠存在炎症因子的异常表达。PCOS 患者的卵巢组织长期处于受到炎性浸润的环境中，生殖能力下降，是由于血清中IL-6 的水平升高，通过激活炎症细胞，释放出更多炎症因子所 导致［22］。严冬梅［23］研究也证实PCOS 患者出现卵巢低反应性，功能下降，促排卵效果不佳，可能与促炎因子IL-17A 的高表达有关。卵巢功能的调节离不开TNF-α 的参与，其与FSH 浓度相关，T 水平增高，能诱导卵泡膜细胞发生增殖，调节卵泡发育、排卵与黄素化［24］。在PCOS 中作为参与炎症和免疫抑制的抗炎因子IL-10 水平降低，可以直接刺激炎症因子产生，提升炎症细胞活性，加剧卵巢生殖功能的炎性状态。采用黄芪、山楂、黄芪-山楂水溶液进行干预性给药后，对比模型组，IL-6、IL-17A、TNF-α 水 平 出 现 不 同 程 度 的 降 低，IL-10 出 现 不 同程度的升高。本研究结果显示黄芪-山楂组IL-17A水平比山楂组降低更显著，IL-10 水平比山楂药组升高更显著（P＜0.05），表明了黄芪-山楂具有抗炎作用，同时也表明了黄芪-山楂能通过减轻炎症状态发挥对PCOS 大鼠卵巢生殖功能的防护作用。

综上所述，黄芪-山楂预防给药可以改善PCOS大鼠的卵巢生殖功能，其作用机制可能与降低促炎因 子IL-6、IL-17A、TNF-α 水 平，提 高 抗 炎 因 子IL-10 水平，减轻炎症状态有关。本研究为PCOS 临床用药提供指导及实验依据，但中药治疗疾病在更深层次的分子层面具有多途径-多靶点的特点，对于PCOS 卵巢生殖功能的作用机制可以进行进一步的探讨。

作者贡献度说明：

张雪娟：实验设计；田秀秀：执行实验，统计分析及文稿撰写；李美霖、龚宇航：执行实验和指标检测；马希雅：补充部分内容；张雪娟：论文指导及校审。

所有作者声明不存在利益冲突关系。