circ-CBLB/miR-486-5p 在脾虚湿盛型类风湿关节炎患者中的异常表达及意义

李 舒，万 磊，刘 健，黄传兵，陈莹莹，李方泽，胡赛赛，程 静

（1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学第一附属医院风湿科，安徽 合肥 230031）

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以关节炎症及免疫细胞浸润为主的自身免疫性疾病［1，2］，巨噬细胞参与了类风湿关节炎发生和发展过程，巨噬细胞在不同因素诱导下呈现不同的表型、功能，即M1 型和M2 型巨噬细胞，类风湿关节炎患者机体内外周血、滑膜和滑液巨噬细胞倾向于M1 型促炎性巨噬细胞极化［3］。极化后M1 型巨噬细胞分泌大量促炎性细胞因子如白介素系列、肿瘤坏死因子、趋化因子等，激活成纤维细胞和破骨细胞，引发一系列炎症反应，造成关节软骨破坏。类风湿关节炎“炎症极化”失衡机制与环RNA（circRNA）、小RNA（miRNA）及信号通路异常激活有关［4］。因此，从circRNA/miRNA 角度研究类风湿关节炎“炎症极化”具有重要意义［5］。本课题组前期通过提取类风湿关节炎患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），采用高通量基因测序筛选差异表达的circRNAs［6］，通过circRNAs 基因测序并结合GEO 数据库发现circ_0066715（CBLB）的差异表达相对较大，通过RNAhybRid 预测发现circ_0066715 与miR-486-5p 存在潜在位点，故本研究选取了两者。同时本课题组前期研究发现类风湿关节炎中医证候学呈现脾虚湿盛和痰瘀互结的特点［7］。“脾虚”在类风湿关节炎的发病中起重要作用。本研究旨在探讨circ-CBLB/miR-486-5p 在脾虚湿盛型类风湿关节炎患者中的异常表达及意义，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入的60 例类风湿关节炎患者来自安徽中医药大学第一附属医院风湿病科门诊及住院部，30 例健康者来自安徽省中医院体检中心，纳入时间为2021 年1 月～2021 年12 月。本研究经安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会批准后实施（No.2019AH-12），纳入对象均签署知情同意书。

1.2 西医诊断标准

参考2010 年美国风湿病学会（American College of Rheumatology，ACR）结合1987 年ACR 修订的类风湿关节炎分类标准和评分系统［8］。根据对患者的详细的病史询问、体格检查及必要的辅助检查诊断。

1.3 中医证候标准

参照《类风湿关节炎病证结合诊疗指南》［9］，中医证型为脾虚湿盛证。主症：肢体关节疼痛肿胀，四肢乏力麻木，形体消瘦，面色晦暗，肌肉萎缩。次症：食欲减退，食少纳呆，大便稀溏。舌象：舌淡红，苔白腻；脉象：脉沉细。

1.4 纳入标准

（1）符合以上分类标准者；（2）患者签署知情同意书；（3）年龄在18～75 岁；（4）疾病活动期患者，28处关节疾病活动度评估（28-joint Disease Activity Score，DAS28）大于2.6。

1.5 排除标准

（1）合并有其他系统如呼吸、心血管和血液系统等严重疾病；（2）关节严重畸形的患者；（3）有精神疾病；（4）在研究开始前至少4 周服用糖皮质激素及其他免疫抑制剂。

1.6 主要仪器设备及试剂

流式细胞仪（CytoFLEX，贝克曼公司）；荧光定量PCR 仪（PIKOREAL-96，Thermo 公司）；酶标仪（RT-6000，雷设公司）；离心机（JW3021HR，嘉文公司）；全自动生化分析仪（7600-020，HITACHI 公司）；全自动血液分析仪（Sysmex K-4500，HITACHI 公司）；全自动血沉分析仪（Vital Monitor-20，ELECTA 公 司）。 CD14-FITC（Biotechnology，B328962）；CD86 - PE - Cyanine5（Biotechnology，B326934）；CD163-APC（Biotechnology，B326936）；氯仿（上海苏懿，20190227）；无水乙醇（上海广诺，20210914）；异丙醇（上海广诺，20210716）；Trizo（Life technogies，350508）；DEPC-H2O（Gene 类 风湿 关 节 炎y Biotech，2107G20）；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（novoprotein，05229413）；ELISA 试剂盒（武汉基因美，GR2021-06）；PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA ERAser（TaKa 类 风 湿 关节炎，AL21115A）。

1.7 观察指标及方法

1.7.1 免疫炎症相关指标 采用血沉管（黑管）采集纳入对象空腹前臂静脉血3 mL，采用全自动血沉分析仪检测血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）；生 化 指 标C 反 应 蛋 白（c-reactive protein，CRP）、类风湿因子（rheumatoid factor，RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（anti-cyclic citrullinated peptide antibody，Anti-CCP-Ab）：用生化管（黄管）采集纳入对象前臂静脉血5 mL，3 ℃～5 ℃下低温凝固后，置于离心机中以4 000 r/min 离心15 min，分离血清后放在-80 ℃冰箱保存，待标本全部收集完成后采用全自动生化分析仪检测。

1.7.2 炎症细胞因子 采用生化管（黄管）采集纳入对象前臂静脉血5 mL，3 ℃～5 ℃下低温凝固后，置于离心机中以4 000 r/min 离心15 min，分离血清后放在-80 ℃冰箱保存，待标本全部收集完成，采用酶联免疫吸附（ELISA）法同一批次检测血清白介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。

1.7.3 M1、M2 巨噬细胞极化标志物 采用流式细胞术检测M1、M2 巨噬细胞极化标志物CD86、CD163。方法：用肝素抗凝管（绿管）采取静脉全血1 mL。人M1、M2 巨噬细胞表达加入带荧光标记的小鼠抗人CD14-FITC、CD86-PE-Cyanine5、CD163-APC 单克隆抗体试剂10 μL，充分混匀，在4 ℃冰箱中反应30 min。以1 500 r/min 离心5 min，去上清。PBS 重悬细胞，流式细胞仪进行检测，结果用Flow Jo 7.6.1 软件分析。

1.7.4 通路相关指标 采用RT-qPCR 检测类风湿关节炎患者与健康对照者PBMCs 中相关基因的表达，具体步骤参考说明书，相关引物如下（表1）。

表1 相关引物Tab 1 Relevant primers

1.7.5 疾病活动相关指标 视觉疼痛评分（visual analogue scales，VAS）、DAS28 评分［10］。类风湿 关节炎疾病低活动度范围为：（2.6＜DAS28＜3.2）、中活动度：（3.2＜DAS28＜5.1）、高活动度（DAS28＞5.1）。分值越高代表疾病活动度越高。

1.7.6 关节症状及脾虚证候积分 参照《中药新药》［11］，关节症状及脾虚证候积分量化标准［12］：关节症状包括关节疼痛、关节肿胀、关节压痛、晨僵。脾虚证候为倦怠乏力、食欲减退、食后腹胀、大便稀溏。按无、轻、中、重程度分级，关节症状分别计0、3、6、9 分，脾虚证候分别计0、2、4、6 分。

2 统计学方法

采用SPSS23.0 统计软件统计分析。计量资料用均数加减标准差（±s）描述，组间比较采用t检验，相关性分析采用Pearson 检验或Spearman 检验。取α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 类风湿关节炎患者免疫炎症指标的变化

与健康者相比，类风湿关节炎组炎症免疫指标ESR、CRP、RF、Anti-CCP-Ab、促炎因子IL-6、TNF-α 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.01），抗炎因子IL-4、IL-10 水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 类风湿关节炎患者免疫炎症指标的变化（±s）Tab 2 Changes of immune inflammatory indexes in RA patients（±s）

表2 类风湿关节炎患者免疫炎症指标的变化（±s）Tab 2 Changes of immune inflammatory indexes in RA patients（±s）

注：**P＜0.01。

指标ESR (mm/h)CRP (mg/L)RF (U/mL)Anti-CCP-Ab (U/mL)IL-4 (pg/mL)IL-6 (pg/mL)IL-10 (pg/mL)TNF-α (pg/mL)健康者(n=30)7.21±3.05 2.42±1.01 4.02±1.56 2.13±0.95 43.68±18.33 2.80±0.98 20.23±5.69 15.38±2.19 RA 组(n=60)59.18±15.26**62.56±16.98**50.89±19.36**60.26±25.89**22.56±8.26**49.64±18.78**6.50±1.72**90.86±30.37**t P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000-19.552-24.849-14.364-13.132 7.405-13.836 17.269-16.581

3.2 类风湿关节炎患者通路基因表达的变化

与健康者相比，类风湿关节炎组circ-CBLB表达水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01），miR-486-5p表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3，图1。

图1 两组circ-CBLB 与miR-486-5p 表达水平的比较Fig 1 Comparison of expression levels of circ-CBLB and miR-486-5p in two groups

表3 两组circ-CBLB 与miR-486-5p 表达水平的比较（±s）Tab 3 Comparison of expression levels of circ-CBLB and miR-486-5p in two groups（±s）

表3 两组circ-CBLB 与miR-486-5p 表达水平的比较（±s）Tab 3 Comparison of expression levels of circ-CBLB and miR-486-5p in two groups（±s）

注：**P＜0.01。

指标t P circ-CBLB miR-486-5p健康者(n=30)1.68±0.50 0.82±0.24类风湿关节炎组(n=60)0.65±0.24**1.93±0.42**0.000 0.000 13.232-13.331

3.3 类风湿关节炎患者巨噬细胞极化标志物表达 水平的变化

与健康者相比，类风湿关节炎组CD14+CD86+表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），CD14+CD163+表达水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表4 及图2、3。

图2 两组CD14+CD86+、CD14+CD163+流式细胞图Fig 2 Flow cytometry of CD14+CD86+ and CD14+CD163+in two groups

图3 两组巨噬细胞极化标志物表达水平的比较Fig 3 Comparison of expression levels of macrophage polarization markers between the two groups

表4 两组巨噬细胞极化标志物表达水平的比较（±s，%）Tab 4 Comparison of expression levels of polarizing markers of macrophages between the two groups（±s，%）

表4 两组巨噬细胞极化标志物表达水平的比较（±s，%）Tab 4 Comparison of expression levels of polarizing markers of macrophages between the two groups（±s，%）

注：**P＜0.01。

指标t P CD14+CD86+CD14+CD163+健康者(n=30)14.12±4.41 29.92±9.03类风湿关节炎组(n=60)19.03±6.31**5.42±2.44**0.000 0.000-14.227 13.060

3.4 类风湿关节炎患者通路基因与炎症极化标志物及免疫炎症之间的相关性

相关性结果显示，类风湿关节炎患者circ-CBLB 表达水平，与CD14+CD163+呈正相关（P＜0.01），与miR-486-5p、CD14+CD86+呈负相关（P＜0.01）；miR-486-5p 表达水平与CD14+CD163+呈负相 关（P＜0.01），与CD14+CD86+呈 正 相 关（P＜0.01）；CD14+CD86+与CD14+CD163+呈负相关（P＜0.01）；ESR 与circ-CBLB 呈负相关（P＜0.01），与miR-486-5p、CD14+CD86+、CRP 呈 正 相 关（P＜0.01）；CRP 与circ-CBLB、CD14+CD163+呈负相关（P＜0.05，P＜0.01），与CD14+CD86+、ESR 呈正相关（P＜0.01）。见表5。

表5 circ-CBLB、miR-486-5p 与CD14+CD86+、CD14+CD163+及免疫炎症相关指标之间的相关性Tab 5 Correlation between circ-CBLB， miR-486-5p， CD14+CD86+， CD14+CD163+ and immune inflammation related indexes

3.5 类风湿关节炎患者通路基因与关节症状、脾虚证候积分之间的相关性

相关性结果显示，类风湿关节炎患者circ-CBLB 表达水平与关节压痛、晨僵、少气懒言、食后腹胀呈负相关（P＜0.05，P＜0.01）；miR-486-5p 表达水平与关节压痛、食欲减退呈正相关（P＜0.05）。见表6。

表6 类风湿关节炎患者通路基因与关节症状、脾虚证候积分之间的相关性Tab 6 Correlation between pathway genes and joint symptoms and spleen deficiency syndrome score in RA patients

3.6 类风湿关节炎患者通路基因表达水平与类风湿关节炎患者疾病活动相关指标的关系

circ-CBLB 在平均数以下为1，平均数以上为2，1 和2 分别对应的ESR、CRP、VAS、DAS28，miR-486-5p 与circ-CBLB 相反。结果显示circ-CBLB 方面（图4），ESR、CRP、VAS、DAS28 AUC 分别为0.662（P=0.032），0.658（P=0.035），0.516（P=0.830），0.791（P=0.000）。miR-486-5p 方面（图4）ESR、CRP、VAS、DAS28 AUC 分 别 为0.566（P=0.385），0.511（P=0.883），0.592（P=0.223），0.727（P=0.003）。结果表明circ-CBLB 表达低水平和miR-486-5p 表达高水平对类风湿关节炎患者的疾病活动的可能有一定的预测价值。

图4 类风湿关节炎患者通路基因与疾病活动相关指标关系的ROC 曲线Fig 4 ROC curve of the relationship between pathway genes and disease activity related indicators in RA patients

4 讨论

类风湿关节炎临床表现为关节肿胀、晨僵、疼痛等症，其分子机理是促炎、抑炎等细胞因子网络紊乱［13］，致使关节炎症增加而出现上述症状。类风湿关节炎中医证候学呈现“脾虚湿盛、痰瘀痹阻”的特征。“脾虚”在“痹证”发病中起到重要作用，具体有如下五种作用：（1）脾失运化，水液不化停聚成痰。（2）脾运不足，生化乏源，气血亏虚。（3）脾气不充，卫外不固，易受湿困。（4）湿滞积聚，日久生瘀，气血运行不畅而使痰湿兼血瘀，最终痰瘀互结，痹阻经络、关节致关节疼痛、肿胀缠绵难愈甚至关节变形。（5）湿邪常与寒、热夹杂，寒性凝滞，侵犯经脉，使血行迟缓，甚至凝滞不通；热邪循环入血，煎熬血液使血行塞滞成瘀；气虚、推动血行无力，则血流不畅，日久成瘀。痰湿日久与瘀血夹杂而致痰瘀互结，关节痹阻。本研究结果显示，与健康者相比，脾虚湿盛型类风湿关节炎患者的促炎因子IL-6、TNF-α 水 平 升 高，抗 炎 因 子IL-4、IL-10 水 平 显 著降低。

类风湿关节炎是一种以关节滑膜炎症、软骨和骨质破坏为主要病理特征的自身免疫性疾病［14］，然而目前该病缺乏有效的早期诊断和治疗，误诊、误治会导致严重的残疾，并最终导致早期死亡。circRNA 是一类新型的内源性表达ncRNA，它是通过共价键形成的，具有较高的稳定性，且与自身免疫性疾病的发生发展密切相关［15-18］，circRNA 相比于其他ceRNAs，与有相应结合位点的miRNA 结合更为紧密，进而可以影响其下游靶基因的表达和功能，因此也被称为“超级海绵”［19］。circRNA 与miRNA 的串扰也被证实是在类风湿关节炎的生理病理过 程 中［20］，其 机 制 是circRNA 竞 争 性 地 与miRNA结合，从而参与滑膜组织和PBMC 中下游基因的调控。本研究结果显示，与健康组比较，脾虚湿盛型类风湿关节炎患者的PBMC 中的circ-CBLB基因表达水平异常下调，miR-486-5p基因表达水平异常上调，且ROC 曲线结果显示：circ-CBLB 的低水平和miR-486-5p 的高水平表达对类风湿关节炎疾病活动度有一定的预测价值。

类风湿关节炎的“炎症极化”也称为“巨噬细胞极化”。巨噬细胞能产生多种促炎性细胞因子和趋化因子参与类风湿关节炎致病过程［21］。类风湿关节炎患者滑膜组织中巨噬细胞数量明显增多。巨噬细胞具有很强异质性和可塑性的功能［22］。巨噬细胞根据表型和功能不同分为M1 型巨噬细胞和M2 型巨噬细胞［23］，M1 型巨噬细胞可分泌多种促炎性细胞因子，表达CD80、CD86 等分子，能促进炎症发展，加速细胞外基质降解和细胞凋亡。M2 型巨噬细胞分泌抗炎细胞因子，表达CD206、CD163 等分子，发挥抗炎作用。类风湿关节炎疾病发展过程中多种因素会打破处于动态平衡的M1/M2 型巨噬细胞，引起数量和比例失衡，导致M1 型巨噬细胞不断增多，从而加剧炎症反应［24，25］。本研究结果显示，脾虚湿盛型类风湿关节炎患者的circ-CBLB 表达水平，与CD14+CD163+呈正相关，与miR-486-5p、CD14+CD86+呈负相关；miR-486-5p 表达水平与CD14+CD163+呈负相关；且免疫炎症方面：CD14+CD86+与炎症指标ESR 和CRP 呈正相关，CD14+CD163+与CRP 呈负相关。同时，脾虚湿盛型类风湿关节炎患者的关节症状与脾虚证候的相关性结果显示：circ-CBLB 表达水平与关节压痛、晨僵、少气懒言、食后腹胀呈负相关；miR-486-5p 表达水平与关节压痛、食欲减退呈正相关。

综上，脾虚湿盛型类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中的circ-CBLB、miR-486-5p 的异常表达与类风湿关节炎的炎症极化标志物、免疫炎症、疾病活动度、关节症状及脾虚证候有关，且circ-CBLB的低水平表达和miR-486-5p 的高水平表达对类风湿关节炎疾病活动度有一定的预测价值。

作者贡献度说明：

李舒：负责文章的整体框架的搭建、数据统计分析及文章撰写；万磊：负责文章思路的构思；刘健、黄传兵：负责检验技术指导；陈莹莹、李方泽：负责实验材料的购买与指标检测；胡赛赛、程静：负责临床资料的收集与整理。

所有作者声明没有任何利益冲突关系。