乳腺癌患者婆罗双树样基因4表达情况及PTEN/AKT/mTOR通路对乳腺癌阿霉素耐药性作用研究

王燕艳, 王 梅, 黄琰菁, 郑佳璇, 郑垂志

海南省人民医院(海南医学院附属海南医院)1.肿瘤内科;2.乳腺外科;3.病理科,海南 海口 570100

乳腺癌为女性高发恶性肿瘤,伴随着多种基因及蛋白表达的改变。有研究发现,乳腺癌早期患者已经出现婆罗双树样基因4(sal-like 4,SALL4)表达升高,SALL4会参与乳腺癌的肿瘤增殖、肿瘤细胞间粘附等多种生物学行为[1]。乳腺癌对化疗较为敏感,化疗是乳腺癌的重要治疗手段之一,但耐药问题会使化疗效果大打折扣,提高乳腺癌患者的化疗敏感性成为当前研究热点[2-3]。以阿霉素为主的蒽环类药物是乳腺癌的常用化疗方案,从分子水平分析乳腺癌对阿霉素耐药的机制可为乳腺癌新的治疗靶点提供参考。SALL4与乳腺癌细胞的阿霉素耐药性有关,而PTEN/AKT/mTOR通路被证实是与乳腺癌耐药性有关的通路[4]。本研究旨在探讨乳腺癌患者SALL4的表达情况,以及PTEN/AKT/mTOR通路对乳腺癌阿霉素耐药性的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取海南省人民医院自2010年6月至2022年6月收治的90例乳腺癌手术患者为研究对象。纳入标准:原发性乳腺癌;术前未接受放疗、化疗、内分泌治疗等抗肿瘤治疗。排除标准:伴其他恶性肿瘤;伴远处转移。患者均为女性;年龄27～63岁,平均年龄(50.46±6.17)岁;肿瘤最大径≤5 cm 52例,最大径>5 cm 38例;病理类型为浸润性导管癌72例,其他18例;组织学分级Ⅰ级12例,Ⅱ级61例,Ⅲ级17例;有淋巴结转移42例,无淋巴结转移48例;雌激素受体(estrogen receptor,ER)阳性50例,阴性40例;人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)阳性36例,阴性54例;孕激素受体(progesterone receptor,PR)阳性44例,阴性46例;Ki67<14% 16例,Ki67≥14% 74例。提取50～100 mg癌组织及癌旁组织(距癌组织边缘>5 cm)置于EP管中,立即放入液氮罐并置于-80℃下保存待测。患者及其家属均签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 SALL4表达检测 (1)免疫组织化学法。乳腺癌组织石蜡切片,厚度4 μm。60℃下烤1 h,依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ等洗脱15 min,无水乙醇Ⅱ 5 min,95%、85%、75%乙醇、蒸馏水分别2 min。微波加热抗原修复液,放入切片,加热10 min。PBS浸泡5 min,3次。吸水,3%H2O2孵育15 min,PBS浸泡。滴加山羊血清并孵育15 min。一抗用PBS稀释50倍,PBS浸泡。二抗用PBS稀释200倍,孵育、浸泡。滴加HRP标记亲和素,孵育、浸泡。等量混合DAB显色试剂A、B,加100 μl显色试剂,待颜色变深时终止显色。苏木素复染3 min,流水冲洗返蓝5 min。切片依次浸入75%、85%、95%乙醇等洗脱、封片。判定标准:每张染色切片均在高倍视野下随机选取5个视野,计数200个细胞;阳性细胞百分比占比0%、占比<25%、25%～49%、占比≥50%分别计0分、1分、2分、3分,染色强度无着色、浅黄色、黄色、棕黄色分别计0分、1分、2分、3分;两项评分相乘,评分≥4分为SALL4阳性,评分<4分为SALL4阴性[5]。(2)Western Blot检测。剪碎适量乳腺癌组织及癌旁组织,加相应裂解液。离心后留取上清。用25.0 mg/ml蛋白标准品稀释至0.5 mg/ml。蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μl加入96孔板中,不足20 μl的孔加蛋白裂解液补至20 μl。其他孔加2 μl待测样品并补至20 μl。加BCA工作液200 μl,37℃下孵育0.5 h。用酶标仪测562 nm处光密度值,绘制浓度曲线。按体积的1/4加5×loading buffer。凝胶电泳,用PVDF膜进行蛋白转膜,脱脂封闭1 h,1×TBST洗膜3次,孵育一抗,摇床30 min,4℃下过夜。用1×TBST洗膜3次,加相应二抗,孵育2 h。洗膜,显色,采用ImageJ软件进行灰度分析[6]。(3)荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测。SALL4引物序列:上游5′-CCGCACTGAGATGGAAGGT-3′,下游5′-GCTGGGCTGCTAACAAAGG-3′。GAPDH引物序列:上游5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′,下游5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′。提取乳腺癌及癌旁组织的RNA,反转录得到cDNA。Oligo(dT)15 1.0 μl、random 1.0 μl加ddH2O至12.5 μl加样,70℃反应5 min,冷却。离心收集反应液,加入dNTP(2.5 mM each)2.0 μl、5×Buffer 4.0 μl、RNasin 0.5 μl、M-MLV 1.0 μl。25℃反应10 min、42℃反应50 min、80℃反应10 min,终止反应。实时荧光定量反应体系包括SYBR GREEN mastermix 10.0 μl、上游与下游引物序列(10μM)各0.5 μl、cDNA 1.0 μl,ddH2O补足至20.0 μl。反应过程包括预变性(94℃ 5 min)、PCR(94℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 30 s,40个循环)及溶解(72℃ 150 s、40℃ 90 s,60℃～94℃每秒1℃,25℃ 1 min)[7]。

1.2.2 SALL4对阿霉素耐药性检测 MCF-7和MCF-7/ADR细胞用浴锅溶解,含10%胎牛血清DMEM培养基重悬,离心,弃上清,重悬后接种,37℃、5%CO2的培养箱内培养24 h,PBS清洗,加新鲜培养基2.5 ml。细胞传代,显微镜下计数。培养细胞至密度为90%,清洗后加入完全培养基终止反应。吹打细胞,收集混合液并离心,去上清后加入1 ml完全培养基。在MCF-7/ADR细胞中沉默SALL4构建shSALL4-MCF-7/ADR细胞。将细胞接种于6孔板中,培养箱内培养24 h。培养24 h后筛选细胞,传代并获得稳定转染的细胞株,培养箱内培养。将MCF-7、MCF-7/ADR、shSALL4-MCF-7/ADR细胞以3×103个/孔接种于96孔培养板,37℃、5%CO2下培养。细胞贴壁后用含不同浓度梯度(0、0.5、1.0、10.0 μM)的阿奇霉素处理3种细胞,MTT法检测24、48 h后的细胞增殖活性。检测时加5 mg/ml的MTT,孵育4 h。弃上清并加200 μl的二甲基亚砜,酶标仪测定490 nm处光密度值,计算IC50。

1.2.3 SALL4表达影响阿霉素耐药通路分析 采用Western Blot检测SALL4对MCF-7、MCF-7/ADR、shSALL4-MCF-7/ADR细胞PTEN、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR表达的影响,以GAPDH作为内参,检测蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 乳腺癌及癌旁组织中SALL4表达水平比较 SALL4主要定位于细胞质,少量定位于细胞核,阳性呈棕黄色颗粒。90例患者中,SALL4表达阳性34例,阳性表达率为37.78%(34/90)。乳腺癌组织中SALL4蛋白相对表达水平和SALL4 mRNA相对表达水平均高于癌旁组织[(1.12±0.17)比(0.93±0.08);(0.063±0.009)比(0.049±0.006)],差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 不同病理特征乳腺癌患者SALL4表达阳性率比较 不同年龄、病理类型、组织学分级、肿瘤大小及ER、PR、HER-2、Ki67表达患者的SALL4表达阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05);有淋巴结转移患者的SALL4表达阳性率高于无淋巴结转移患者,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同病理特征乳腺癌患者SALL4表达阳性率比较/例(百分率/%)

2.3 SALL4对乳腺癌细胞阿霉素耐药性影响 阿霉素处理24、48 h后的MCF-7/ADR细胞的IC50均高于MCF-7细胞[(135.17±28.08)μM比(1.46±0.14)μM;(31.94±4.09)μM比(0.17±0.04)μM],差异有统计学意义(P<0.05),细胞增殖活性逐渐提高。在MCF-7/ADR细胞中沉默SALL4 24、48 h后的shSALL4-MCF-7/ADR细胞的IC50较MCF-7/ADR细胞降低[(45.86±5.59)μM比(135.17±28.08)μM;(5.77±0.36)μM比(31.94±4.09)μM],差异有统计学意义(P<0.05),即沉默SALL4后MCF-7/ADR细胞对阿霉素敏感性增强。

2.4 SALL4对PTEN/AKT/mTOR通路影响 MCF-7/ADR细胞的PTEN蛋白表达低于MCF-7细胞,p-AKT和p-mTOR蛋白表达高于MCF-7细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。沉默SALL4后,shSALL4-MCF-7/ADR细胞的PTEN蛋白表达升高,高于MCF-7/ADR细胞,p-AKT和p-mTOR蛋白表达下降,低于MCF-7/ADR细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 SALL4对PTEN、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表达影响

3 讨论

近年研究发现,SALL4表达与肿瘤的迁移、侵袭等有关[8]。本研究结果显示:90例患者中,SALL4表达阳性34例,阳性表达率为37.78%(34/90);不同年龄、病理类型、组织学分级、肿瘤大小及雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体、Ki67表达患者的SALL4表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05),有淋巴结转移患者的SALL4表达阳性率高于无淋巴结转移患者(P<0.05)。淋巴结转移是乳腺癌细胞侵袭、转移能力及预后的影响因素,考虑与SALL4影响钙粘素表达有关[9-10]。目前,SALL4表达与乳腺癌病理特征的关系仍然存在争议。有研究发现,SALL4在乳腺癌及癌旁组织中均有表达,且在乳腺癌组织中的表达高低不等[11-12]。还有研究报道,SALL4在乳腺癌早期就已高表达,且与病理特征无明显关系[13]。乳腺癌SALL4表达与病理特征之间的关系有待大样本量研究进行验证。

有研究发现,SALL4表达与肿瘤的耐药性有关,RNA干扰沉默SALL4后可促进胶质瘤细胞凋亡,抑制细胞侵袭,增加细胞对替莫唑胺的化学敏感性[14-15]。也有研究表明,SALL4表达会影响乳腺癌细胞的耐药性[16-17]。阿霉素是乳腺癌常用的蒽环类化疗药物,通过扩散进入肿瘤细胞胞质并与蛋白酶体结合转移至细胞核中解离并释放,直接作用于癌细胞DNA,从而阻碍其核酸合成,并干扰DNA复制、转录等过程,诱导肿瘤细胞凋亡。单独用阿霉素或阿霉素联合其他抗肿瘤药是有效控制乳腺癌进展的关键,但部分患者对阿霉素的反应性低或在阿霉素化疗一段时间后效果变差[18-19]。积极寻找与耐药性相关的分子或基因、揭示乳腺癌的耐药机制是强化乳腺癌化疗效果的重要前提。本研究使用人乳腺癌细胞系MCF-7及其阿霉素耐药细胞系MCF-7/ADR,并构建了沉默SALL4的shSALL4-MCF-7/ADR细胞系,在上述3种细胞系中进行阿霉素处理,结果显示:阿霉素处理24、48 h后的MCF-7/ADR细胞的IC50均高于MCF-7细胞,差异有统计学意义(P<0.05);在MCF-7/ADR细胞中沉默SALL4 24、48 h后的shSALL4-MCF-7/ADR细胞的IC50均较MCF-7/ADR细胞降低,差异有统计学意义(P<0.05)。这提示,SALL4的表达会促进阿霉素耐药,沉默SALL4可提高MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性,促进细胞耐药性下降,使细胞增殖受到抑制,即SALL4与MCF-7细胞的耐药性相关[20-21]。

为了验证SALL4表达对阿霉素耐药性的影响是否与PTEN/AKT/mTOR通路有关,本研究采用Western Blot法对MCF-7、MCF-7/ADR、shSALL4-MCF-7/ADR细胞的PTEN、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表达进行检测,结果显示:MCF-7/ADR细胞的PTEN蛋白表达低于MCF-7细胞,p-AKT和p-mTOR蛋白表达高于MCF-7细胞,差异有统计学意义(P<0.05);沉默SALL4后,shSALL4-MCF-7/ADR细胞的PTEN蛋白表达升高,高于MCF-7/ADR细胞,p-AKT和p-mTOR蛋白表达下降,低于MCF-7/ADR细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。这提示,SALL4表达会影响PTEN/AKT/mTOR通路基因的表达。在PTEN/AKT/mTOR通路中,PTEN是起始基因,通过调节AKT/mTOR去磷酸化而影响该信号通路[16]。沉默SALL4会上调PTEN表达,抑制AKT/mTOR去磷酸化,使p-AKT、p-mTOR表达下调,抑制该信号通路,从而减弱乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性,增强对阿霉素的敏感性[22-23]。有研究报道,加入去甲基化药物可上调PTEN表达,增加成人急性淋巴细胞白血病细胞对伊马替尼的敏感性,而使用AKT或mTOR抑制剂也可提高化疗药物的敏感性。上述研究均证实,PTEN/AKT/mTOR通路与化疗药物的耐药性有关[24-25]。

综上所述,SALL4在乳腺癌组织中的表达高于癌旁组织,且与淋巴结转移明显相关。沉默SALL4可抑制乳腺癌细胞的增殖活性,降低阿霉素的耐药性,且SALL4对乳腺癌细胞阿霉素耐药性的影响与PTEN/AKT/mTOR通路有关。