长链非编码RNA HOX转录反义RNA对微小RNA-519c-3p/骨形成蛋白Ⅱ型受体调控骨关节炎进展作用及分子机制

范忠诚, 王琮仁, 符策岗, 陈晓峰

1.中南大学湘雅医学院附属海口医院 骨科中心,海南 海口 570208;2.海口市骨科与糖尿病医院 骨科中心,海南 海口 570208

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是由关节软骨缺陷引起的关节疾病[2]。OA是老年人常见的关节疾病,常导致疼痛和功能限制,最终降低生活质量[2]。然而,OA的分子发病机制尚不明确,因此,治疗策略的发展受到限制[3]。长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)是一类长度>200 nt的RNA。大量研究报道,多种失调的LncRNA参与了OA的发生发展[4-7]。LncRNA HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)位于12q13.13,是具有反式作用的LncRNA[8]。已有研究证实,LncRNA HOTAIR上调可促进肿瘤细胞生长、集落形成、迁移和侵袭[7]。但其在OA发病中的潜在分子机制尚处于初步探索阶段[9]。本研究旨在探讨LncRNA HOTAIR/miR-519c-3p/骨形成蛋白Ⅱ型受体(bone morphogenetic protein receptor 2,BMPR2)信号轴在OA进展中的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。脂多糖购自北京索莱宝公司;SYBR Premix Ex Taq GC试剂盒购自TAKARA公司;双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司;CCK-8试剂购自TargetMol公司。

1.2 研究方法

1.2.1 微小RNA-519c-3p过表达 细胞接种于6孔板过夜培养后,微小RNA-519c-3p(microRNA-519c-3p,miR-519c-3p)过表达慢病毒转染细胞,24 h后获得miR-519c-3p过表达细胞系。

1.2.2 酶联免疫吸附剂测定 在4℃条件下于平板上包被抗体过夜,封闭后将上清样品加入孔中与抗体进行孵育。进行显色,终止后测定450 nm波长处吸光光度值。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应检测 TRIzol RNA试剂提取总RNA,检测RNA浓度后逆转录成cDNA,通过SYBR Premix Ex Taq GC试剂盒进行实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)。

1.2.4 蛋白质印迹 细胞样品冰上裂解后,BCA试剂盒测定浓度,上样30 μg聚丙烯酰胺凝胶电泳,转印至PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,加入一抗后于4℃孵育过夜。次日复温清洗后二抗孵育2 h,显影检测蛋白表达。抗体均购于Abcam公司。

1.2.5 双荧光素酶报告实验 根据预测的结合位点设计引物,并构建LncRNA HOTAIR野生型和突变型双荧光素酶载体。各组细胞转染48 h后,参照试剂盒操作说明检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 LncRNA HOTAIR负向调控miR-519c-3p的表达 ENCORI网站预测LncRNA HOTAIR可能与miR-519c-3p结合(图1a)。双荧光素酶报告实验显示,与HOTAIR-WT质粒共转染时,miR-519c-3p组荧光素酶活性低于对照组,组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与HOTAIR-MUT质粒共转染时,对照组与miR-519c-3p组荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1b。RIP实验检测结果显示,miR-519c-3p组细胞与Ago2抗体结合的样品中LncRNA HOTAIR的富集显著(P<0.05,图1c)。LncRNA HOTAIR在生物素化的miR-519c-3p的吸附物中也显著富集(P<0.05,图1d)。qRT-PCR结果显示,si-HOTAIR组miR-519c-3p的相对表达量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05,图1e);HOTAIR组miR-519c-3p的相对表达量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05,图1f)。

图1 LncRNA HOTAIR负向调控miR-519c-3p的表达(a.生物信息学网站预测位点;b.细胞中的荧光素酶活性;c.Ago2在不同组细胞中富集LncRNA HOTAIR;d.生物素在不同组细胞中富集LncRNA HOTAIR;e.si-HOTAIR组miR-519c-3p的相对表达情况;f.HOTAIR组miR-519c-3p的相对表达情况)

2.2 miR-519c-3p的过表达抑制了人软骨细胞OA的进展 qRT-PCR结果显示,转染miR-519c-3p模拟物后,miR-519c-3p组miR-519c-3p相对表达量高于NC组,差异有统计学意义(P<0.05,图2a)。CCK-8实验结果显示,与NC组比较,miR-519c-3p组软骨细胞增殖速度变慢(P<0.05,图2b)。qRT-PCR结果显示,与NC组比较,miR-519c-3p过表达后,细胞中降基质金属蛋白酶(matrix metallopeptidase,MMP)3、MMP9、MMP13、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif,ADAMTS)4、ADAMTS5及促炎因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的mRNA水平显著降低,而COL2A1、SOX9和Aggrecan的mRNA水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05,图2c、d)。蛋白质印迹(western blot,WB)结果显示,与NC组比较,miR-519c-3p组MMP3、MMP9、MMP13、ADAMTS4、ADAMTS5蛋白表达水平降低,COL2A1、SOX9蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05,图2e)。酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)结果显示,与NC组比较,miR-519c-3p组的IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低,差异有统计学意义(P<0.05,图2f)。

图2 miR-519c-3p过表达抑制人软骨细胞OA的进展(a.miR-519c-3pRNA的表达水平;b.各组细胞的生长情况;c.各组细胞中OA相关基因的mRNA表达水平;d.OA相关基因在不同组细胞中的mRNA表达水平;e.各组细胞中OA相关基因的蛋白表达水平;f.各组细胞上清中促炎因子的表达水平)

2.3 miR-519c-3p负向调控BMPR2的表达 生物信息学网站TargetScanHuman预测BMPR2是miR-519c-3p的下游靶点(图3a)。双荧光素酶报告的结果如下:miR-NC或miR-519c-3p 与BMPR2-WT共转染细胞后,NC组荧光素酶活性高于miR-519c-3p组,差异有统计学意义(P<0.05),但二者与BMPR2-MUT共转染组间的荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05,图3b)。qRT-PCR结果及WB结果发现,miR-519c-3p过表达后,miR-519c-3p组BMPR2的mRNA及蛋白表达水平低于NC组,差异有统计学意义(P<0.05);miR-519c-3p表达被抑制后,miR-519c-3p sponge组的BMPR2的mRNA及蛋白表达水平高于miR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3c、d。此外,当细胞过表达LncRNA HOTAIR后,HOTAIR组的BMPR2的mRNA及蛋白表达水平高于Control组,差异均有统计学意义(P<0.05);LncRNA HOTAIR表达被抑制后,siHOTAIR组的BMPR2的mRNA及蛋白表达低于siNC组,差异有统计学意义(P<0.05,图3e、f)。

图3 miR-519c-3p负向调控BMPR2的表达(a.生物信息学网站TargetScanHuman 8.0预测二者结合位点;b.各组细胞荧光素酶活性;c.miR-519c-3p过表达及被抑制后不同组细胞BMPR2的mRNA水平;d.miR-519c-3p过表达及被抑制后不同组细胞BMPR2的蛋白水平;e.LncRNA HOTAIR过表达及被抑制后不同组细胞BMPR2的mRNA水平;f.LncRNA HOTAIR过表达及被抑制后不同组细胞BMPR2的蛋白水平)

2.4 LncRNA HOTAIR通过miR-519c-3p/BMPR2调控人软骨细胞OA的进展 与NC组比较,si-HOTAIR组BMPR2表达水平降低,而si-HOTAIR+miR-519c-3p sponge组BMPR2的RNA水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05,图4a)。WB结果趋势相同(图4b)。

图4 LncRNA HOTAIR通过miR-519c-3p/BMPR2调控人软骨细胞OA的进展(a.不同组细胞BMPR2的mRNA水平比较;b.不同组细胞BMPR2的蛋白水平比较;c.不同组细胞活力比较;d.不同组细胞降解酶及促炎因子的基因mRNA相对表达量比较;e.不同组细胞软骨标志基因mRNA相对表达量比较;f.不同组细胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平比较)

CCK-8实验结果显示,与NC组比较,si-HOTAIR组增殖变慢,si-HOTAIR+miR-519c-3p sponge组细胞增殖变快(P<0.05)。与 NC组比较,miR-519c-3p组细胞增殖变慢,miR-519c-3p+BMPR2组细胞增殖变快(P<0.05)。见图4c。

qRT-PCR结果显示,与NC组比较,si-HOTAIR组中降解酶(MMP3、MMP9、MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5)及促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的基因mRNA相对表达量显著降低,而软骨细胞标志基因COL2A1、SOX9和Aggrecan的mRNA相对表达量上调(P<0.05);与si- HOTAIR组比较,si-HOTAIR+miR-519c-3p sponge组细胞的降解酶和促炎因子的基因mRNA相对表达量升高,软骨标志基因mRNA相对表达量却下调(P<0.05)。同样,qRT-PCR结果显示,与NC组比较,miR-519c-3p组降解酶和促炎因子基因mRNA相对表达量降低,软骨标志基因mRNA相对表达量增加(P<0.05);但与miR-519c-3p组比较,miR-519c-3p+BMPR2组细胞的降解酶和促炎因子的基因mRNA相对表达量升高,软骨标志基因mRNA相对表达量下调(P<0.05)。见图4d、e。

ELISA实验结果显示,促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α在不同组别中的表达水平表现出与各促炎因子基因mRNA相对表达量相同的趋势(图4f)。这些结果提示,LncRNA HOTAIR通过miR-519c-3p/BMPR2调控人软骨细胞OA的进展。

3 讨论

LncRNA HOTAIR在癌症生物学中具有重要的致癌作用[9]。近年来,有研究报道,LncRNA HOTAIR在OA病理中具有多种功能[9-10]。本研究阐明了LncRNA HOTIAR/miR-519c-3p/BMPR2轴在调节OA进展中的作用。

本研究利用生物信息学网站ENCORI分析LncRNA HOTAIR潜在的下游分子miR-519c-3p,双荧光素酶报告实验和RIP实验证实了miR-519c-3p可与LncRNA HOTAIR相结合,qRT-PCR和WB结果发现LncRNA HOTAIR和miR-519c-3p的表达呈负相关。这提示LncRNA HOTAIR可以靶向调控下游miR-519c-3p的表达。

有研究报道,miR-519c-3p可通过靶向BTG3促进肝癌的生长和转移[11]。此外,抑制LncRNA NEAT1通过调节miR-519c-3p/MeCP2轴促进黑色素瘤细胞对顺铂的敏化[12]。但miR-519c-3p在OA中的作用少见报道。本研究结果发现,miR-519c-3p过表达后,软骨细胞生长变慢,降解酶(MMP3、MMP9、MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5)及促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平降低,而COL2A1和SOX9水平升高,这提示miR-519c-3p可以抑制OA进展。鉴于过往LncRNA HOTAIR可促进OA进展的研究[10],这提示miR-519c-3p和LncRNA HOTAIR在OA的进展上具有拮抗作用,这也与LncRNA HOTAIR负向调控miR-519c-3p表达的结论相符。

miRNA家族构成了精密的调控网络[13]。本研究利用生物信息学和双荧光素酶报告基因实验预测并证实miR-519c-3p、BMPR2相互结合。上调miR-519c-3p表达后BMPR2表达降低;反之miR-519c-3p被抑制后BMPR2的表达增高。这提示,miR-519c-3p不仅可以与BMPR2结合,并可调控其表达水平。此外,本研究结果显示,LncRNA HOTAIR表达被抑制后,BMPR2表达下调;LncRNA HOTAIR过表达后,BMPR2表达随之增高。基于LncRNA HOTAIR对miR-519c-3p的负调控作用,这提示LncRNA HOTAIR通过下调miR-519c-3p水平削弱了miR-519c-3p对BMPR2的抑制。综上,miR-519c-3p可以负向调控BMPR2的表达。

本研究结果发现,LncRNA HOTAIR干扰的软骨细胞中感染miR-519c-3p sponge,可以逆转干扰LncRNA HOTAIR对BMPR2的下调,这提示BMPR2的表达被LncRNA HOTAIR显著激活,而被miR-519c-3p抑制。BMPR2对于软骨的形成以及关节修复具有重要的影响[14]。本研究通过回补实验也进一步验证了miR-519c-3p通过靶向BMPR2轴调控软骨细胞生长、降解酶及促炎因子的分泌,这提示,LncRNA HOTAIR不仅调控下游miR-519c-3p/BMPR2的表达,更通过miR-519c-3p/BMPR2途径调控OA的进展。

综上所述,LncRNA HOTAIR可通过miR-519c-3p/BMPR2轴调控OA的进展。本研究为阐明OA进展的分子机制、筛选OA特异性生物标志物提供重要依据。