‘红地球’与‘金星无核’葡萄杂交群体果实香气物质遗传分析

朱骏驰，郭印山，郭修武*

（1. 上海农林职业技术学院植物科学技术系，上海 201699；2. 沈阳农业大学园艺学院，辽宁沈阳 110866）

葡萄属多年生落叶藤本植物，不同地域的地理条件和自然环境促成了葡萄品种多样化，并已开发出很多配套的栽培技术。随着葡萄经济价值不断被发掘，现代葡萄种植产业高度发达，鲜食葡萄及加工后的葡萄干、葡萄酒等产品备受人们的青睐[1]。

随着葡萄种植技术的不断发展，葡萄种质资源持续改良。草莓香型、玫瑰香型是葡萄的两种典型香型，具有较高的经济价值[2-3]。一般认为，香气物质多数作为数量性状，在遗传上由多基因控制，少数表现为受一对或多对基因控制的质量性状[4]。本试验使用固相微萃取技术与气相色谱质谱联用仪，通过构建杂交群体检测种间杂交后代香气物质及分析草莓香型香气物质遗传特点，为草莓香型葡萄新品种选育及香气物质的相关基因筛选提供表型数据基础及理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以亲本‘红地球’（母本）与‘金星无核’（父本）及种间杂交后代为试材，后代未经人为选择。2008年5月进行杂交，秋季选取饱满及无霉菌感染的杂交种子，同年10月至2009年2月进行层积处理，3月对杂交种子进行催芽处理及温室营养钵点播，4—6月进行移栽定植和挂牌标记，2012年以后大部分实生苗结果，现所有试验材料均定植于沈阳农业大学葡萄试验基地（41°50′24″N，123°24′41″E），长势良好。杂交后代群体共有531株，随机选取其中183株连同亲本用于本研究。由于试材果实成熟期不同，用果实糖度含量与种子呈褐色作为果实成熟鉴别依据。为了避免过早或过晚采集样品，每72 h对样本成熟度进行田间调查，一般在8月下旬至10月上旬陆续采集。

果实采集时，兼顾阴阳面每一样品植株取3穗果，每穗随机取20个成熟度一致且无机械损伤的果实，按照相同采样标准重复3次。摘取的果实放入提前做好标记的自封袋中，在经液氮速冻后，-80 ℃超低温保存备用[5]。2016年采集共计151份材料包括149个结果后代单株与两个亲本，2017年采集共计161份材料包括159个结果后代单株与两个亲本，进行香气测定与分析。

1.2 仪器与设备

气相色谱质谱联用仪器（GC-MS）；氮氢空一体机（Nitrogen-hydrogen Air Machine）；SPME手柄及萃取头；榨汁机；多功能恒温搅拌器。

1.3 试验方法

葡萄果实中香气物质成分及含量通过NIST11标准质谱库匹配及标准品制备标准曲线后进行定性定量分析，试验中设置的固相微萃取条件以李志文等[6]的方法为参考。萃取步骤：将低温保存的葡萄样品化冻至室温，在每一样品中称取30～40 g作为萃取样品，剔除果实中的种子与果梗，用榨汁机榨汁，抽取8 mL样品放入离心管离心5 min，转入容量为20 mL顶空瓶内搅拌，加入干燥后的磁力与3.0 g NaCl后混匀密封；将SPME萃取头轻缓插入顶空瓶后推出石英纤维；样品加热至60 ℃，以950 r·min-1的速度进行磁力搅拌；静置吸附40 min，回抽石英纤维和萃取头，转入气相色谱进样口；加温至250 ℃，完全干燥后用仪器解析5 min，同步记录所有数据。试验中采用的进样口以无分流模式为主，萃取头在使用前经1 h的270 ℃高温老化处理。

G C 分析：绘制色谱柱V F-Wa x m s 毛细管柱（30 m×0.25 μm，0.25 mm），注入高纯度He，在流速为1 mL·min-1下通过250 ℃的进样口，不分流手动进样，解析5 min。温控步骤：先将初始温度调整为60 ℃，持续3 min，按照3 ℃·min-1的升温速度提至120 ℃，保持2 min，再按5 ℃·min-1的速度升至210 ℃，保持5 min。

MS条件：GC-MS传输线250 ℃、EI离子源200 ℃，电子能量70 eV、广电倍增管电压为350 V，在荷质比（m/z）45～600 amu范围内启用全扫描模式。

1.4 数据处理

质谱图采集结束后，在系统中打开N I S T Chemistry WebBook，在信息检索栏查找相关测试数据，将质谱图中的数据与检索得到的数据进行对比，评测匹配程度以确定香气中的物质成分。采用SIMCA 14.1统计分析软件中PCA分析模块确定香气物质中的主成分，并绘制香气成分中的标准品主成分曲线，采用定量分析法解析香气成分。

采用Excel 2019对亲中值、子代均值和变异系数等相关遗传指标进行统计计算，相关计算公式参照《果树育种学》及相关文献[7-9]计算方法。

2 结果与分析

2.1 两品种杂交后代香气物质鉴定

从亲本的香气成分数据对比上看，水杨酸甲酯、大马士酮、苯乙醇、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯的含量不同是造成亲本葡萄果实样品香气成分差异的主要原因，分别对应出峰时间为25.851、28.312、31.144、40.484、45.546 min。

2.2 两品种杂交后代酯类香气物质的遗传分析

图1为3种主要的酯类香气物质（水杨酸甲酯、邻苯二甲酸二甲酯和邻苯二甲酸二丁酯）在亲本及杂交后代中含量分布情况。可以看出，在2016、2017两年试验中3种酯类香气物质遗传存在相似性，即酯类香气物质在父本‘金星无核’中的含量均高于在子代中的含量，绝大多数子代中的含量高于母本‘红地球’中的含量。

图1 在亲本和杂交后代中酯类香气物质含量分布Figure 1 Content distribution of ester aroma compounds in parental and hybrid progeny

由表1可以看出，连续两年的各酯类香气物质的变异系数范围在123.2%～251.4%，可以看出杂交后代酯类香气物质分离趋势广泛，选择潜力大。遗传传递力最小为2017年邻苯二甲酸二甲酯的116.7%，最大为2017年邻苯二甲酸二丁酯的197.8%，且超低亲率明显高于超高亲率，在遗传效应上呈现典型的趋小性遗传特征。

表1 ‘红地球’和‘金星无核’及杂交后代中各香气物质的遗传变异Table 1 The hereditary variation of aroma compounds in 'Red Globe' 'Venus Seedless' and their hybrids%

2.3 两品种杂交后代大马士酮香气物质的遗传分析

大马士酮是异戊二烯代谢合成途径产生的葡萄果实香气组分，具有花香、木瓜等气味特征，虽然含量较低但受到其低阈值的影响，对葡萄及葡萄酒丰富的花果香味具有重要的贡献[10-11]。有研究表明，大马士酮可以通过与葡萄及葡萄酒中其他香气成分互作，增强果香[12-14]。

本试验中大马士酮香气物质全部遗传到所有杂交后代中，属于连续变量的数量性状遗传。通过图2可以看出，其遗传特点两年大体上一致，即父本‘金星无核’中大马士酮的含量均高于子代的中间值，母本‘红地球’中大马士酮的含量小于绝大多数子代中的含量，其中2016年大马士酮在母本‘红地球’中的含量小于所有子代中的含量。

图2 在亲本和杂交后代中大马士酮含量分布Figure 2 Content distribution of damascenone in parental and hybrid progeny

通过表1可以看出大马士酮两年的变异系数分别为228.9%和157.4%，且2016年亲本与子代葡萄果实中大马士酮含量均值低于2017年（图2），2017年含量分布范围更广表明杂交后代大马士酮香气物质分离趋势大，选择潜力大。大马士酮遗传传递力两年平均为53.7%，超高亲率两年均大于50%，显著高于超低亲率（13.4%和15.5%），说明大马士酮香气物质遗传给杂交后代的能力比较强，在遗传效应上呈现典型的趋大性遗传特征。

2.4 两品种杂交后代苯乙醇香气物质的遗传分析

苯乙醇是一种从植物资源中发现的芳香族化合物，在苹果、猕猴桃、桃、树莓、葡萄等多种果树中均有发现，具有清甜的花香味，被广泛应用于调味料和化妆品中[15-19]。通过表1可以看出，苯乙醇两年的变异系数均值为223.5%，遗传传递力都不低于130.1%。两年间超低亲率分别为37.3%和62.6%，远高于超高亲率，在遗传效应上呈现典型的趋小性遗传特征。

苯乙醇在杂交后代出现了分离的遗传表现，2016年和2017年分别在86个和85个杂交后代中检测到了苯乙醇香气物质，在后代群体中分别占比57.7%和53.5%，经卡方检验计算求得卡方值分别为3.55和0.76，均小于P值3.84，说明苯乙醇符合质量性状的遗传规律。两年间苯乙醇在父本‘金星无核’中的含量均远高于子代含量的中间值（图3），但在母本‘红地球’中的含量2016年远低于子代含量的中间值，2017年略高于子代含量的中间值，表明两年间苯乙醇在杂交后代中表现出了不完全相同的遗传特点。

3 讨论与结论

葡萄杂交育种过程中，受亲本基因正向及反向的影响，后代杂交性状广泛分离，形成一些超高亲植株，这也正是有性杂交的意义[20-22]。

葡萄香气是近年来消费者最在意的性状之一，也是重要的商品指标。葡萄的草莓香味，也称狐香，主要在美洲种及欧美杂交后代的果实中存在，这种独特香味的形成与多种酯类挥发性物质及降异戊二烯类物质有关[23-25]。目前，有关香气物质遗传规律研究多数选用玫瑰香型葡萄为试材，关于草莓香型葡萄特征香气物质遗传规律的研究报道相对较少。郭印山等[26]对以玫瑰香型葡萄品种‘87-1’为亲本构建的杂交群体进行研究，发现主要香气物质萜稀类化合物在杂交后代呈广泛分离，其中香叶醇在遗传效应上呈典型的增强变异，部分香气物质受环境影响较大。刘若瑾等[27]认为，26种单萜化合物是构成玫瑰香型葡萄的主要香气物质，杂交后代中果实香气物质种类基本相同，在含量上有巨大差异，导致不同单株的果实香气产生差别。曹亚平[28]研究发现，无香型葡萄品种‘京秀’与草莓香型葡萄品种‘布朗无核’的杂交后代中仅有11.1%呈现草莓香型，大部分均为无香型。孙婷[29]研究认为，草莓香型葡萄主要香气物质为酯类化合物，种间杂交后代大部分的酯类香气物质呈低亲遗传效应。

本研究剖析了以‘红地球’和‘金星无核’葡萄杂交F1代果实中5种主要香气物质遗传规律。发现5种主要香气物质变异系数均大于100%，后代出现广泛分离，选择潜力大，其中大马士酮2016年的变异系数最大，选择潜力最大。水杨酸甲酯、邻苯二甲酸二甲酯与邻苯二甲酸二丁酯在父本中的含量远高于母本，且在后代中出现了连续的变异，平均遗传力为153.2%，符合数量性状遗传特点。亲本均值高于大部分杂交后代果实中酯类化合物的含量，呈现趋低遗传。何明茜[30]研究草莓香型香气物质遗传特点时也发现，酯类化合物在草莓香型亲本中含量远高于无香型亲本品种，少数酯类化合物如苯甲酸乙酯等有超亲遗传的现象，这些结果的不同可能是因为亲本遗传背景及试材地点气候的差异，说明葡萄酯类化合物遗传是非常复杂的。

在研究中也发现了大马士酮和苯乙醇对草莓香型香味的形成贡献率较高，并且连续两年大多数子代中大马士酮的含量高于亲本，在后代中也出现了连续变异，且超高亲率均超过50%，表现为趋大的遗传倾向。

苯乙醇在后代群体中检测到的比率分别为57.7%和53.5%，通过卡方适合性检验计算，检测出苯乙醇的次数与理论分离比例为1∶1，符合质量性状不连续变异的遗传特点。李坤等[31]研究欧美杂交品种‘紫珍香’自交后代中发现，香气成分苯乙醇也符合质量性状的遗传特点。

辽宁沈阳属北温带大陆性气候，气候温和，雨量适中，光照充足，且秋季昼夜温差较大，有利于优质葡萄的生产。结合沈阳气象局公布的气象数据，2017年沈阳降水量为463.8 mm，不足2016年967.9 mm的一半，为枯水年，日照时数与平均气温均多于2016年，表明不同年份间气候的差异对降异戊二烯香气物质的合成积累产生了一定的影响。2017年大马士酮在亲本中的含量相比2016年显著增加，表明干旱、炎热的年份对大马士酮的积累有积极的作用[32]。Xie等[33]研究发现，葡萄果实大马士酮的含量受温度、湿度、日照时长及无霜天数等的强烈影响。此外也有研究表明，干旱、摘叶、整形方式及果实大小等因素均影响葡萄果实中香气物质大马士酮的积累[34-37]。

综上所述，育种者可以从杂交后代中挑选一些草莓香型香气物质高于亲本的优系个体进一步选育，同时也更应该关注草莓香型特征香气物质的遗传规律。