带状疱疹后神经痛病人Treg/Th17 与发病时间的相关性研究*

庄茂林 潘旻升 孙明洁 于 洋 姜祖波 赵政政 张本旺 江 峰 陈付强 △

（1 潍坊医学院麻醉学院，潍坊261000；青岛市市立医院东院区2 疼痛科；3 检验科，青岛266011）

带状疱疹 (herpes zoster, HZ) 皮疹愈合后持续1个月及以上的疼痛定义为带状疱疹后神经痛 (postherpetic neuralgia, PHN)[1]。PHN 是HZ 最常见最严重的并发症，老年HZ 病人罹患PHN 的比例高达75%[2]。PHN 带来的慢性疼痛给病人带来极大地痛苦，严重影响病人生活质量，临床上一些病人忍受病痛折磨长达数年。而PHN 的发病机制至今仍未阐明，临床上缺乏预测PHN 病程长短的方法。

最近的一项研究证实，外周血中的水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus, VZV)特异性T 细胞随着年龄的增长而减少，而调节性T 细胞 (regulatory T cells, Treg) 会增加[3]。病毒感染中的Treg 细胞可以控制抗病毒炎症但它们抑制抗病毒免疫力，间接促进了病毒复制，并导致持续的病毒感染。辅助性T 细胞 (helper T cell, Th17) 在宿主抵御一些病毒感染方面发挥着重要作用，但它们可能会导致有害的免疫病理反应[4]。最近的研究已经证实，Treg/Th17的平衡在HZ 的疾病发展中起到重要作用[5]。 且有研究证实，Treg/Th17 与PHN 疼痛程度呈负相关，但是Treg/Th17 的高低与发病时间的关系没有得到阐明。为解决临床中无法预估PHN 病人发病时长、预后情况的问题，本研究立足于免疫相关的Treg 细胞与Th17 细胞，阐明了PHN 病人Treg/Th17 失衡与发病时间的关系，以求可以帮助了解PHN 这一疾病在转归过程中免疫功能的变化。甚至基于维护两细胞平衡对病人免疫功能水平进行预防性治疗，改善病人预后。

方 法

1.一般资料

本研究通过青岛市市立医院伦理委员会审核（伦理批号2023061），已与病人家属沟通后签署知情同意书。选取2021 年2 月至2022 年9 月青岛市市立医院疼痛科收治的PHN 病人48 例，其中疱疹部位为头面部9，上肢1 例，季肋区6 例，胸背部12例，腰腹部18 例，下肢2 例。年龄50～93 岁，平均年龄69.7 岁，男22 例，女26 例。选取健康对照组22 例，均为同期门诊健康体检者，年龄54～81 岁，平均年龄70.7 岁，男10 例，女12 例。两组在年龄、性别等方面比较差异无统计学意义 (P＞ 0.05)。

纳入标准：符合PHN 诊断标准，疼痛数字分级评分法(numerical rating scale, NRS)评分在4 分及以上，且具有典型的HZ 临床症状和体征，沟通无障碍，能够配合NRS 评分的评估，在过去的1 个月内，没有使用免疫抑制剂（如糖皮质激素）等可影响T 淋巴细胞亚群的药物。

排除标准：伴有严重心、肺、肾等系统性疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病和应用免疫抑制剂，以及精神病或不合作者。

2.主要试剂及仪器

小鼠抗人单克隆抗体 (CD4-FITC/CD25-APC)、Foxp3 固定破膜工作液、红细胞裂解液 (Optilyse C)法国 Immunotech 公司；小鼠单克隆抗体(Foxp3-APC)英国abcam 公司；流式细胞仪(Epics XL·MCL)：美国 BECKMANCOULTER 公司；低温高速离心机：德国 Heraeus 公司；37℃恒温箱：北京福意电器有限公司；Varioskan Flash 全波长扫描式多功能读数仪。

3.方法

资料收集：收集病人的淋巴细胞亚群检测结果，内容包括总淋巴细胞、T 淋巴细胞、诱导性T细胞(CD4+T)、杀伤性T 细胞(CD8+T)、NK 细胞。病人的临床资料包括性别、年龄、发病至就诊时间、疱疹位置等。

标本收集：在病人初诊时抽取静脉血10 ml 于肝素输液管中，用等体积的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)稀释后，采用密度梯度离心法分离外周血单个核淋巴细胞。用于后期Th17 和Treg 细胞检测。

Treg 细胞检测：Treg 细胞被定义为CD4+CD25+-Foxp3+T 细胞。为了确定Treg 细胞比例，将单个核淋巴细胞PBS 重悬，调节PBMC 浓度为1×106个/ml左右。使用CD4-FITC 和CD25-APC 单克隆抗体对Treg 细胞表面进行染色，以检测PBMC 的细胞表面抗原。然后，使用流式染色缓冲液洗涤，加入1 ml Fixation 破膜缓冲液，4℃避光孵育45 min；用破膜缓冲液洗涤2 次，加入20 μl Foxp3-APC，4℃避光孵育30 min；经破膜缓冲液洗涤2 次，用500 μl 流式染色缓冲液重悬，上机检测，荧光数据的获得以荧光强度 ＞ 3000 个个体细胞为阳性，经分析后将CD4+CD25+Foxp3+T 细胞相对于CD4+总细胞的比例转换为百分比，以获得Treg 细胞的数量。

Th17 细胞检测：Th17 细胞被定义为产生白介素17 (interleukin-17, IL-17)的辅助T 细胞。将单个核淋巴细胞PBS 重悬后，调节 PBMC 浓度保持在1×106个/ml 左右。之后按照流式检测试剂盒说明书操作，分别加入固定液、破膜剂，抗体混合液，每种试剂加入后均按说明进行避光、孵育、离心、洗涤。用500 μl 流式染色缓冲液重悬，上机检测，荧光数据的获得以荧光强度 ＞ 3000 个个体细胞为阳性，结果最终以每个细胞的平均荧光强度表示。

4.统计学分析

采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析，采用均数 ± 标准差(±SD)表示，独立样本t检验用于评估HZ 和对照组之间各淋巴细胞亚群、Treg 细胞、Th17 细胞和Treg/Th17 细胞比率的差异。使用Pearson 相关测试分析Treg/Th17 与发病时间的关系。P＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

1.PHN 组和对照组外周血中各淋巴细胞亚群比较

将对照组和PHN 组外周血中各淋巴细胞亚群数量进行比较，发现PHN 组的CD4+细胞(23.11±7.38)少 于 对 照 组(29.55±10.54)，而PHN 组CD8+细胞(46.98±7.9)多于对照组(42.39±8.34)，PHN 组CD8+/CD4+细胞比率(2.32±1.1)高于对照组(2.32±1.1)，差异具有统计学意义（P＜ 0.05，见图1、图3）。

图1 PHN 组和对照组各淋巴细胞亚群百分比(±SD)Fig.1 Percentages of each lymphocyte subset in the PHN group and control group (±SD)

2.PHN 组和对照组外周血中的Treg 和Th17 细胞计数比较

对照组和PHN 组外周血中的Treg 细胞和Th17 细胞数量进行比较，发现PHN 组的Treg 细胞(4.23%±2.27%)多于对照组(3.09%±1.61%)，差异具有统计学意义(P＜ 0.05)。且与对照组(0.94%±0.98%)相比，PHN 组的Th17 细胞(1.58%±1.08%)增多（见图2）。为了进一步研究两个T 细胞亚群之间的平衡，计算了Treg 细胞与Th17 细胞的比率。PHN 组Th17/Treg 细胞比率(0.92±1.07)显著高于对照组(0.38±0.36)，差异具有统计学意义（P＜ 0.05，见图3）。PHN 组与对照组外周血Treg 细胞的流式细胞结果图见图4。PHN 组与对照组外周血Th17 细胞的流式细胞结果图见图5。

图2 PHN 组和对照组Treg 细胞与Th17 细胞百分比(±SD)Fig.2 Percentages of Treg cells and Th17 cells in the PHN group and control group (±SD)

图3 PHN 组和对照组Treg/Th17 与CD8+/CD4+比率(±SD)Fig.3 Treg/Th17 and CD8+/CD4+ ratios in PHN group and control group (±SD)

图4 PHN 组和对照组外周血Treg 水平的流式细胞图像对比Fig.4 Flow cytometric comparison of peripheral blood Treg levels between PHN group and control group

图5 PHN 组和对照组外周血Th17 水平的流式细胞图像对比Fig.5 Flow cytometric comparison of Th17 levels in peripheral blood between PHN group and control group

3.PHN 病人Th17/Treg 与PHN 发病时间的相关性分析

48 例PHN 病人中，平均发病时间为(37.8±3.5)天，经Pearson 相关性分析显示，PHN 病人外周血中Th17/Treg 与发病时间呈正相关（r= 0.738，P＜0.01，见图6）。

图6 PHN 病人Treg/Th17 与发病时间的相关性分析Fig.6 Correlation analysis between Treg/Th17 and time of onset in patients with postherpetic neuralgia

讨 论

PHN 是VZV 病毒感染神经系统的一种长期并发症，5%～30%的HZ 病人在皮疹后的神经损伤中会遭受PHN 带来的剧痛[6]。研究表明PHN 的发生与机体细胞免疫紊乱、被异常抑制相关[7]。免疫功能与HZ 及其后遗神经痛的发生有关，免疫系统的功能低下可能会导致VZV的再次激活和HZ的发生。老年人、免疫系统功能减弱的人、器官移植病人、艾滋病病毒感染者等人群更容易患HZ。有研究显示HZ 病人IgG、IgM 和IgA 水平均较同年龄段健康体检人群明显下降，这提示HZ 病人存在体液免疫功能下降[8]。最近一项研究显示，在新型冠状病毒大流行期间，HZ 病人病例大幅增加，这更提示我们免疫功能的减弱可能是诱发HZ 的原因[9]。

原始CD4+T 细胞可以在某些条件下分化为Th1、Th2、Treg 和Th17 细胞并产生各种介导免疫反应的细胞因子。转化生长因子TGF-β 诱导原始CD4+T细胞分化为Treg 细胞，以产生TGF-β 和IL-10，减少炎症反应。IL-6 诱导原始CD4+T 细胞分化为Th17，使其产生IL-17、IL-23 并增加炎症反应，同时抑制原始CD4+T 细胞分化为Treg 细胞。可以说IL-6 是Treg 细胞与Th17 细胞之间平衡的调节器[10]。一项单中心回顾性研究结果显示，与对照组相比，PHN 病人的IL-6 水平更高，且血清中IL-6 水平可以用作PHN严重程度的生化指标[11]。这可能意味着，随着IL-6 的升高，Th17 细胞的数量增加，导致了更严重的炎症反应。

Treg 分化和Th17 分化是相关的过程，两个T 细胞亚群在维持免疫系统稳态方面发挥着重要作用。Xue-Song 等[12]研究也证实了Treg 细胞和Th17 细胞在病毒感染性疾病（如慢性肝炎）中的作用，并表明Treg 细胞和Th17 细胞之间的平衡失调可能在疾病进展和病毒持续性中发挥重要作用。

已有研究结果显示，PHN 病人外周血中Treg细胞的数量显著高于正常对照组，并随着疼痛严重程度的增加而增加[13]。本研究表明，HZ 病人的免疫力受损，Treg 细胞的数量增加可能会抑制CD4+T细胞的抗病毒免疫反应。由此可以推断Treg 细胞可能在HZ 的发病机制和PHN 进展中发挥重要作用[13]。本研究检测了病人外周血中Treg、Th17 细胞数量并计算了Treg/Th17，探讨了与健康对照人群相比，Th17 和Treg 两种细胞的数量变化及是否存在平衡失调的情况。结果显示，与对照组相比PHN病人外周血中Treg 细胞的数量显著增加，Th17 细胞数量显著增加。且PHN 病人Treg/Th17 明显高于对照组。本研究还统计了PHN 病人与健康对照者外周血中各淋巴细胞亚群水平，结果显示与对照组相比，PHN 病人外周血中CD4+细胞显著减少，CD8+细胞显著增多，PHN 组CD8+/CD4+细胞比率显著升高。本研究结果表明抗病毒的免疫反应随着Treg 细胞的增加而减少，且导致疾病爆发后CD4+细胞的相对减少。此外，随着Th17 细胞的增加，免疫炎症反应也随之增加，这可能是导致神经损伤并进一步导致PHN 的原因。此外，我们认为Treg细胞与Th17 细胞在HZ 疾病发展的不同时间段发挥不同的作用，Treg 细胞的增加可能与HZ 急性期VZV 的持续复制且进一步造成PHN 有关，而Th17细胞的数量可能与PHN 的疼痛程度及累计范围呈正相关。

已有研究显示，HZ 病人Treg/Th17 与PHN 的疼痛程度呈负相关[14]。本研究结果显示，Treg/Th17与PHN 病人的发病时间呈正相关。这可能意味着在疾病的进程中，随着Treg 细胞的相对增加，其带来的免疫抑制效应也增加，抗病毒的免疫反应相对减少，使得VZV 病毒更长时间地在外周血中复制，延长病程。另外，据既往研究表明，在炎症因子的诱导下，Th17 细胞与Treg 细胞间存在相互转化[15]。本研究结果也显示，PHN 病人外周血中Treg/Th17随着时间的推移而上升，这意味着Treg 的相对增加。这可能与这两个T 细胞子集的可塑性有关，其中Th17 细胞可能在炎症细胞因子的作用下转化为Treg 细胞[16]。一项研究也表明在风湿性关节炎病人外周血中，病理性的Th17 细胞可以转化Treg 细胞，发挥抗炎的功能[17]。且已有研究证明，Treg 细胞与Th17 细胞之间存在一种CD4+Foxp3+IL-17+的中间型细胞，这也为两者之间的转化提供有力的证据[18]。是否在PHN 病人外周血中存在Th17 向Treg细胞转化，使外周血中Treg 数量上升，导致后遗神经痛病程的延长呢？这一点仍需我们的后期研究得以阐明。

本研究局限性在于，所采集样本量较少，且已知Treg 细胞随年龄增加而增加，在探究Treg/Th17与发病时间相关性时，未考虑PHN 组内年龄因素。另外，本研究仅能证实Treg/Th17 与发病时间呈正相关，无法得出PHN 病人因Treg/Th17 的升高而发病时间延长的结论。

综上所述，机体免疫功能失衡可能是PHN 发病的重要原因，而Treg/Th17 细胞的比例失衡可能是机体复杂的免疫调节中关键一环。且本研究可初步确定，Treg/Th17 细胞的比例失衡与PHN 发病时间呈正相关，PHN 病人Treg 细胞的相对升高可能与Th17 细胞向Treg 细胞的转化有关，但具体机制仍不明确，需要后续研究进行验证。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。