重组酶聚合酶扩增技术在动物疫病诊断中的应用研究进展

胡清霞,李 颖,张琰杰,吕 妮,李 鹏,杨增岐,王兴龙*

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100;2.农业农村部反刍动物重大疫病 防控重点实验室(西部),陕西杨凌 712100;3.陕西省铜川市新区坡头街道办事处,陕西铜川 727000)

动物疫病病原菌检测方法主要有传统鉴别方法和分子生物学方法等,聚合酶链反应(PCR)以其特异、灵敏、便捷等优点被广泛应用于各类疾病诊断[1]。但是目前PCR以及后来发展的荧光定量PCR、数字PCR等技术在动物疫病诊断中存在着依赖昂贵仪器设备、专业人员及检测时间长等局限,不适合疾病暴发时现场快速检测。近几年来,恒温核酸扩增技术解决了以上问题,其中重组酶聚合酶扩增(RPA)技术可在25～42℃条件下进行快速核酸扩增,无需控温设备,操作简单,且其特异性、灵敏度与PCR相当甚至高于PCR[2]。被认为是最可能替代PCR的检测技术,做到真正走出实验室,在资源匮乏的偏远地区实现现场快速检测。

1 RPA反应原理

1.1 反应原理

RPA反应是以T4噬菌体复制为主要反应机理,主要依赖单链DNA结合蛋白(SSB),能结合单链核酸的重组酶(UvsX)和链置换DNA聚合酶[3]。反应体系包括引物、模板DNA、ATP、醋酸镁、水、聚乙二醇、UvsY蛋白(T4噬菌体重组调节蛋白)、二硫苏糖醇及Mg2+等。重组酶在ATP、UvsY蛋白的参与下与引物结合形成蛋白-DNA复合物,再在双链DNA中寻找同源序列后,复合物插入双链DNA形成D-环结构。D环的一侧是双链,其中引物与模板链杂交,启动链交换反应,而D环的另一侧与单链DNA蛋白结合[4]。重组酶从复合物中水解出来,引物在链置换DNA聚合酶作用下从3′端开始延伸,对模板上的目标区域进行扩增,新生成的DNA链被用于另一轮RPA。

1.2 RPA引物、探针设计

引物设计是RPA检测技术中极为重要的一环,30～35 bp是最适引物长度,比PCR引物长。在RPA检测中,引物过短会使反应灵敏度和速度下降;引物过长易导致非特异性增加形成引物-二聚体[5]。RPA引物设计时碱基含量为30%～70%,过高过低会导致链交换速率缓慢;应注意5′端不要连续出现鸟嘌呤,且最好设计有胞嘧啶;在3′端引物序列不匹配会导致RPA工作效率降低,所以3′端设计时最好选择鸟嘌呤和胞嘧啶。为使RPA扩增效果最佳,其扩增子长度最好为100～200 bp[6]。若要构建荧光定量RPA和LFD-RPA (侧流层析试纸条)检测方法,需要设计专门的探针进行高灵敏度扩增子检测,长度46～52 bp,在引物设计时留下足够空间。其中荧光团和淬灭团标记在胸腺嘧啶上,间距1～5 bp,两者中间以四氢呋喃(THF)取代一个核苷酸,3′端需要用阻断基团(如C3 spacer)进行修饰封闭[7]。荧光定量RPA可用与RPA技术兼容的exo探针,侧流层析试纸条法常用nfo探针。

1.3 RPA的检测方法

1.3.1 凝胶电泳 用琼脂糖凝胶电泳检测RPA扩增产物,即基础RPA。在进行凝胶电泳前,由于扩增产物中的蛋白质阻碍电泳成像,导致拖带形成,在扩增产物中加入酚和氯仿抽提取乙醇沉淀纯化后再电泳[8],在操作过程中减少开盖,分区操作减少气溶胶污染,其他操作同PCR。

1.3.2 实时荧光定量RPA 在基础RPA上,实时荧光定量RPA加入了核酸外切酶Ⅲ和exo荧光探针,收集荧光信号实时监测目的基因拷贝数。如非洲马瘟病毒的荧光定量RPA快速检测方法[9],虽然非洲马瘟还未传入我国,但建立高效快速的检测方法是必要的。

1.3.3 侧流层析试纸条 RPA-侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)是将RPA与LFD结合检测扩增产物,与基础RPA相比,加入了核酸外切酶Ⅳ、nfo探针及带生物素标记的下游引物。LFD是基于侧流层析技术、免疫学技术和胶体金技术制备的一种试纸条,主要由样品垫、检测线和质控线组成,扩增产物用LFD检测可肉眼观察到结果,降低了操作人员的专业要求,如对猪流行性腹泻病毒的快速诊断研究[10]。还有电化学生物传感器、电化学转导、比色反应、桥联絮凝分析、硅微环谐振器光子检测等方法也可以用于RPA扩增产物的检测[11]。

2 RPA检测技术在动物疫病诊断中的应用

2.1 RPA在猪疫病诊断中的应用

2.1.1 病毒类 非洲猪瘟的临床症状及病理变化与猪瘟、猪丹毒、沙门氏菌等疾病相似,需要实验室特殊诊断才能确诊,且该病毒基因型较多,变异能力强,目前尚无可靠疫苗,因此快速检测对其防控非常重要。有研究建立一种改进的实时荧光RPA检测非洲猪瘟病毒(ASFV),可在39℃、30 min内实现对ASFV P72基因核酸提取、扩增和判定,最低检测限为 10 拷贝/μL,灵敏性比PCR高。从PCR到改进的RT-RPA,灵敏度从2×103copies升高至10 copies,该方法采用室温裂解法可取代传统核酸提取方法,能直接用于RPA扩增,降低了样品处理时间和成本,同时该研究建立的RT-RPA对实验仪器的兼容性强,扩大了应用场地范围[12]。对MGF360-12L基因建立的RPA检测方法灵敏性为1×103copies,与荧光定量PCR检测相近[13]。对猪圆环病毒2型建立了一种RPA方法结合侧流层析试纸条的可视化(LFS-RPA)检测技术,该方法基于PCV2cap基因特异性保守序列设计了RPA特定引物和nfo探针,39℃扩增20 min,再用侧流层析试纸条检测扩增产物,短时间内实现猪圆环病毒临床样品的可视化快速检测,检出限为10 copies,其灵敏性比环介导恒温核酸扩增(LAMP)方法高10倍,而实时荧光PCR在检测病毒核酸含量较低的临床样品时,效果优于RPA检测[14]。也有RPA对猪瘟[15]、猪细小病毒[16]、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒[17]等病毒的检测病毒,都是采用实时荧光RT-RPA检测方法,检测限分别达到70重组质粒、300重组质粒、70重组质粒。可见RPA技术与实时荧光方法结合检测扩增产物的方法趋于成熟,具有实时监测扩增产物的优点,但相比于与凝胶电泳和侧流层析试纸条两种检测方法,实时荧光不适合终点检测。RPA与凝胶电泳方法结合即与PCR最为类似,称为基础RPA,如对猪德尔塔冠状病毒的检测,检出限可达103拷贝/μL[18]。

2.1.2 细菌类 猪大肠杆菌病包括仔猪水肿、仔猪白痢、仔猪黄痢病3种。针对stx基因用RPA结合圆盘式微流控芯技术快速检测产类志贺毒素大肠埃希氏菌(STEC),该方法可在39℃ 20 min内实现高通量检测,在人工污染品检测中,其按照ISO 16140标准计算,未出现假阳性或假阴性结果[19]。针对大肠埃希氏菌O157的rfbE基因研究开发了一种RT-RPA和LFS-RPA,LFS-RPA检出限为3.5×102fg/μL,比RT-PCR和RT-RPA高出10倍[20]。在实用性验证中,RT-RPA和LFS-RPA都在15 min内获得阳性结果,而RT-PCR需要28～45 min,说明RPA检测方法实用性好、特异性高、灵敏快捷,可用于资源有限的地区作现场检测。

2.1.3 寄生虫与支原体 猪是旋毛虫易感染人,旋毛虫幼虫包囊对外界抵抗力较强,日常烹饪如熏烤、腌制、煎炒等一般不能将其杀死。建立一种快捷、灵敏特异的检测方法有利于对猪旋毛虫的防控。针对旋毛虫的rrnS保守基因序列设计引物及探针建立了RPA-LFD检测方法,检出限可达100个DNA[21]。猪肺炎支原体病也是危害养猪业发展的重要疫病之一,对其mhp165保守基因建立了实时荧光RPA和RPA-LFD两种检测方法,检出限可达5.0×102fg,前者可实时检测扩增进程,后者可肉眼观察检测结果。在临床样品诊断中,RPA检出率与PCR相当[22]。

2.2 RPA在牛、羊疫病诊断中的应用

2.2.1 病毒类 在对于牛羊病毒类疾病的诊断中,RPA结合实时荧光技术建立了对小反刍兽疫[23]、裂谷热[24]、绵阳痘[25]等病毒病的诊断方法。检出限分别为14.98拷贝、10个RNA分子、4.72×102拷贝/μL。在临床样品检测中,实时荧光RPA与实时RT-PCR检出结果具有一致性。也有RPA技术结合侧流层析试纸条诊断牛、羊病毒类疾病的报道,如口蹄疫[26]、羊口疮[27],针对口蹄疫病毒血清型A、O和Asia的检测限分别可达3拷贝质粒DNA、50拷贝质粒DNA,RPA-LFD方法在126份临床样品检测中,与rPCR符合率为98.41%;对于羊口疮病毒的检测限可达80拷贝。但对于RPA-LFD检测羊口疮病毒的临床应用还需要更多的样本用以验证。

2.2.2 细菌类 布鲁氏菌病多发于牛、羊、猪等动物,人类直接接触患病动物易导致感染,因此建立布鲁氏菌的灵敏特异的现场检测方法对防控布鲁氏菌病非常重要。针对布鲁氏菌的bcsp21保守基因序列设计了特异性引物,建立了RPA技术结合侧流层析试纸条(LFD)快速检测布鲁氏菌的方法,最低检测限度为5.89 CFU/mL,在模拟样本检测中,其结果与ELISA检测结果一致[28]。此外,副结核分支杆菌感染导致牛的副结核病,导致其肠炎、腹泻、消瘦等症状。传统检测方法耗时耗力,如变态反应、补体结合试验等。针对牛副结核分支杆菌的F57基因建立了RPA-LFS检测方法,检测限可达12拷贝,对57份牛腹泻临床样本的检测结果与实时荧光PCR方法检测结果一致[29]。

2.2.3 寄生虫与支原体 针对牛支原体的uvrC基因建立了RT-RPA和LFS-RPA两种方法检测牛支原体,检测限均为1.0×101拷贝,在65个临床样本中,其结果与实时荧光定量PCR的结果一致[30]。说明RPA不仅可作为牛支原体的实验室常规检测手段,也可作为快速现场手段直接检测牛场中的牛乳支原体含量。日本血吸虫主要感染人及犬、牛、羊、猪等,针对日本血吸虫SjCHGCS19基因设计了特异性引物和nfo探针,建立了日本血吸虫的RPA检测技术结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)的快速检测方法,该方法对日本血吸虫成虫基因组DNA的最低检出限位10-6ng(1 fg),该方法与埃及血吸虫、曼氏血吸虫等血吸虫具有较强交叉反应[31]。

2.3 RPA在禽类疫病诊断中的应用

2.3.1 病毒类 对H5N1亚型禽流感建立了实时荧光定量RT-RPA快速检测方法,该方法可在39℃ 20 min快速完成检测,灵敏度可达到10 copies,其结果与标准实时荧光RT-PCR检出结果一致[32]。说明该方法灵敏性好、特异性强,且不依赖设备,适用于现场快速检测。对禽白血病毒的J亚群(ALV-J)的gp85基因设计特异性引物和exo探针,建立了实时荧光定量RPA快速检测方法,该方法可在38℃ 20 min实现快速检测,检出限可达10 copies/μL。在临床样本检测实践中,实时RPA、PCR和实时PCR的禽白血病毒阳性率分别为66.13%(41/62)、59.68%(37/62)和分别为67.74%(42/62)。实时RPA与实时PCR诊断符合率为98.39%(61/62)[33]。说明RPA方法适用于现场检测,特别是在实验仪器匮乏的情况下使用,从而更好地进行ALV-J的预防和控制。

2.3.2 真菌类 家禽感染白色念珠菌会引起消化道疾病,消化道黏膜产生溃疡和白色假膜。针对常见的机会致病菌白色念珠菌,建立了RPA快速检测方法,同时构建了LFD-RPA方法,该方法针对ITS序列设计引物,可在37℃ 20 min完成检测,对于1×101copies/μL 标准品阳性检出率为78%,对1×102～1×107copies/μL标准品阳性检出率为100%,且灵敏性与PCR相当[36]。说明RPA可用于白色念珠菌早期快速诊断,具有特异型好、灵敏度高和便捷等优点。

2.4 RPA在犬、猫疫病诊断中的应用

2.4.1 病毒类 基于犬细小病毒(CPV)的VP2基因建立了基础PRA、LFD-RPA快速检测方法。RPA的两种检测方法都可在38℃ 15 min内即可特异检测出犬细小病毒,两者检出限均为1×101拷贝/μL。在临床CPV粪便疑似阳性的样本检测中,RPA、LFD-RPA的犬细小病毒检出率为88%,高于胶体金(76%)和普通PCR(80%)[34]。说明RPA检测方法特异性强、灵敏度高,较PCR更简便快捷,适用于CPV的临床快速检测。针对犬副流感病毒(CPIV)建立了核衣壳蛋白基因保守序列的实时荧光定量RPA检测方法,该方法可于39℃孵育25 min的条件下快速检测犬副流感病毒,检测下限为3.0×101.0TCID50/mL[35],在临床疑似阳性临床样品、健康样本以及其他感染脏器样本的检测中,实时荧光RPA与实时荧光PCR方法结果基本相符。

2.4.2 寄生虫类 弓形虫病的终末宿主为猫科动物。针对B1基因设计引物建立了弓形虫Exo-RPA检测方法,该方法可在39℃ 20 min完成检测,检测限达102copies/μL,比实时荧光定量PCR提高了10倍,在对180份肉类样品检测结果与qPCR阳性率一致[36]。

2.5 RPA在其他疫病诊断中的应用

RPA技术结合侧流层析试纸条检测志贺毒素大肠埃希氏菌[37]、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌[38]、土拉弗氏菌[39]等,对志贺毒素大肠埃希氏菌stx1、stx2基因序列设计引物及探针,检出限分别为1 pg、10 pg;对金黄色葡萄菌的nuc基因和沙门氏菌invA基因设计引物及探针,基础RPA检测方法检出限分别为30 CFU/mL、20 CFU/mL,RPA-LFD检测方法检出限分别为20 CFU/mL、15 CFU/mL;对土拉弗氏菌的ul4保守基因序列的检出限达20 fg/μL。也有RPA-LFD诊断寄生虫的报道,如曼氏血吸虫[40]、广州管圆线虫[41],检出限分别为10 fg/μL、20 pg/μL。RPA技术诊断真菌病的研究相对较少,有研究建立了酵母菌、霉菌的RPA-LFD检测方法,检出限分别达1.0 CFU/50 g、45.7 孢子/50 g[42]。

3 小结与展望

RPA技术在动物疫病诊断中的应用已趋于成熟,其灵敏性、特异性都与PCR相当或者更优,具有脱离实验室的优点,但仍存在一些不足,如尚无专业软件对其引物和探针进行设计和筛选;该技术使用引物与探针较长,无对80 bp以下的较短序列进行核酸扩增;由于反应时间短,难以控制大量样品同时检测的时间,影响检测效率;在与琼脂糖凝胶电泳结合检测产物时,需要纯化产物防止拖带的形成;操作不当易受到气溶胶的污染导致假阳性;成本高,即使RPA时间短、仅需用价格低廉的仪器降低了许多成本,但相对于PCR约1元1次,目前商用的液体RPA试剂盒成本约30元1次,其余类型试剂盒价格更为昂贵,这也是RPA技术仍未大量投入临床应用的原因之一。对RPA技术仍有许多问题有待解决,如开发专业引物探针设计软件,优化核酸提取方法,如室温裂解法;开发便携式、一体化和全自动RPA检测设备,减少假阳性的产生,提高RPA诊断效率;寻找重组酶替代酶、自主表达所需蛋白等从而降低检测成本,使RPA技术更贴近缺乏基础设施的偏远地区;由于RPA最适反应温度接近人类体温,也可开发更为便捷的温度条件,如手握和提取体液等利用体温完成RPA的检测。RPA技术的普及程度还远不及PCR技术,且短时间内不会替代PCR,RPA用于现场检测的目标仍有距离,期望在动物疫病诊断及其他领域的应用会超越PCR技术。