中药抗神经细胞凋亡的研究进展❋

林冀鲁,焦文鑫,周芷伊,王 影

(中国中医科学院眼科医院,北京 100040)

神经细胞凋亡是涉及一系列基因激活与双向调控的程序性主动死亡过程。与细胞死亡不同,细胞凋亡需要能量,一般无炎症反应或炎症反应较轻,细胞超微结构改变表现为细胞皱缩,核固缩,细胞膜完整,凋亡小体(死亡单位)形成并被巨噬细胞吞噬[1]。神经细胞具有接受刺激、传递兴奋从而实现信息交换的重要功能,其大量凋亡会影响神经系统信息的交换,在相关疾病的发生、发展过程中影响较大[2]。所以,寻找抗神经细胞凋亡的药物和方法并研究其机制具有重要意义。近年来,中药治疗神经系统疾病取得了良好的临床效果,因此该文查阅国内外文献,对神经细胞凋亡途径及中药针对不同靶点抗神经细胞凋亡的作用机制进行了综述。

1 神经细胞凋亡途径及作用机制

神经细胞凋亡过程复杂,受多条信号通路调控,各信号通路间既相互独立又相互影响。目前较为经典的凋亡途径主要包括:死亡受体(death receptor,DR)通路、线粒体通路以及线粒体以外的细胞器应激介导的通路,前者为外源性凋亡途径,后两者均属于内源性凋亡途径[1]。神经细胞凋亡信号通路见图1。

图1 神经细胞凋亡信号通路

1.1 死亡受体通路

死亡受体通路通过DR的死亡配体激活。DR是一类跨膜蛋白,其胞内死亡结构域(death domain,DD)具有蛋白水解功能[3]。目前已知的促凋亡DR主要有自杀相关因子(factor associated suicide,Fas)、肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)以及肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis including ligand,TRAIL)的受体DR4和DR5,其配体分别为Fas配体(fas ligand,FasL)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和TRAIL[4]。

FasL与Fas结合,活化Fas胞内死亡区三聚体,细胞内的DD募集Fas相关死亡结构域蛋白(fas-associated death domain,FADD)。另外,膜结合型或可溶型TNF-α与TNFR1结合,细胞内的DD招募肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域蛋白(TNF receptor-associated death domain,TRADD),进一步募集FADD,FADD通过死亡效应结构域(death effector domain,DED)募集半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-8的前体,形成死亡诱导信号复合物(death inducing signaling complex,DISC),活化Caspase-8,进而激活Caspase-3,引起细胞凋亡。另一方面,活化的Caspase-8可以切割胞浆内的促凋亡蛋白Bid,形成片段化的Bid,进而调控B细胞淋巴瘤(b-cell lymphoma,BCL)-2家族蛋白,使线粒体外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP)改变,释放凋亡调节因子细胞色素C(cytochrome c,CytC),通过Caspase-9/3促使细胞凋亡[4]。Caspase-8的激活是死亡受体通路介导细胞凋亡的关键环节,在此过程中凋亡抑制蛋白(flice inhibitory protein,FLIP)起到负向调控作用[5]。此外,膜结合型TNF-α与TNFR2结合可激活核因子(nuclear factor,NF)κB和c-Jun N-末端激酶(c-jun n-terminal kinase,JNK)通路,诱导细胞凋亡。

1.2 线粒体通路

线粒体通路是一种通过释放CytC等凋亡调节因子激活Caspase家族蛋白导致细胞凋亡的生物化学通路。CytC的释放依赖于线粒体膜通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)的开放及MOMP的增加。

细胞受到外源性损伤时可导致MPTP开放,线粒体膜间隙内的凋亡调节因子如CytC释放入胞质,在ATP或dATP存在的情况下,CytC与凋亡激活因子(apoptotic protease activating factor,Apaf)-1结合,活化并募集Procaspase-9,三者共同形成 “凋亡体”复合物,激活Caspase-9,继而活化关键的终末剪切酶Caspase-3,导致细胞凋亡[5]。另外,MOMP受到BCL-2家族蛋白的调节[6]。BCL-2家族蛋白包括:促凋亡蛋白,抗凋亡蛋白以及BH3-only蛋白[7]。促凋亡蛋白高表达时,MOMP增加,CytC等凋亡调节因子从线粒体释放到胞浆内,引起一系列级联反应,最终导致细胞凋亡,而抗凋亡蛋白的效应机制则与之相反。其中,BCL-2和BCL-2相关X蛋白(bcl-2 associated x protein,BAX)是抑制和促进细胞凋亡的两个标志性凋亡蛋白,BCL-2/BAX的比值决定了细胞抑制凋亡作用的强弱。

1.3 线粒体以外的细胞器应激介导的通路

1.3.1 内质网通路 内质网(endoplasmic reticulum,ER)具有合成蛋白质、维持钙稳态等功能。蛋白质折叠是蛋白质合成的关键环节,错误折叠的蛋白不能被转运出细胞而在胞内蓄积,影响细胞活性。炎症和氧化应激是内质网中错误折叠和未折叠蛋白质积累的两个重要原因。在这种情况下,细胞会出现一种保护性应激反应,统称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。如果内质网错误折叠和未折叠蛋白持续存在,UPR的机制会由保护性变为破坏性,细胞内环境不能及时修复则诱导进一步的炎症和细胞凋亡,这种现象被称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[8]。内质网通路即ERS引起的细胞凋亡,包括增强子结合蛋白同源蛋白(enhancer-binding protein-homologous protein,CHOP)通路、JNK通路、内质网特有的Caspase-12通路[9]。

CHOP通路是指在ERS状态下,内质网膜的三类应激传感蛋白激活转录因子(activating transcription factor,ATF)4、蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase r-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、需肌醇酶(inositol requiring enzyme,IRE)1活化,诱导CHOP表达增加,通过下调BCL-2,上调BAX表达,导致细胞凋亡[10]。JNK通路在炎症细胞因子等刺激下可以被激活。活化的JNK既可以移位到细胞核激活核转录因子,上调死亡配体蛋白表达量,导致细胞凋亡;还可以移至线粒体,调节BCL-2家族蛋白,通过线粒体通路引起细胞凋亡[11]。ERS可引起Caspase-12特异性表达,活化的Caspase-12转移到胞质中,通过Caspase-9/3诱发凋亡。ERS状态下,一方面,与IRE1结合的JNK抑制激酶(c-jun n-terminal inhibitory kinase,JIK)使肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 4,TRAF2)磷酸化,而后三者形成复合物,这使得原本与TRAF2相结合的Procaspase-12脱离,Procaspase-12自我切割且活性部分相互连接,形成片段化的Caspase-12。另一方面,Caspase-7可以从胞质转移到内质网膜,活化Caspase-12[12]。此外,ERS导致Ca2+大量释放,激活具有蛋白水解作用的钙蛋白酶,从而激活Caspase-12[13]。

1.3.2 高尔基体、溶酶体与细胞凋亡 研究发现,氧化应激可通过各种途径引起高尔基体碎裂导致凋亡途径的激活,这与胞浆中主要位于高尔基体的Caspase-2密切相关。溶酶体中的组织蛋白酶在凋亡早期可释放到胞浆,影响MOMP,促进CytC释放,通过内源性线粒体通路诱导细胞凋亡[14]。

2 中药抗神经细胞凋亡的作用

研究显示,神经细胞凋亡与神经系统退行性疾病、脑出血、脑外伤、视网膜变性等密切相关,因此寻找合适的药物干预凋亡信号的转导,抑制细胞凋亡的启动或阻断已启动的细胞凋亡具有积极的治疗意义。目前越来越多的研究发现中药提取物及其有效成分或中药复方对于抑制神经细胞凋亡具有明显作用,但其具体的机制和临床疗效还需进一步证明。

2.1 调控相关凋亡蛋白

2.1.1 以Caspase家族、BCL-2家族蛋白为靶点

2.1.1.1 中药有效成分或提取物 杨芳等[15]经实验发现葛花总黄酮保护糖尿病视网膜神经细胞的机制与提高BCL-2蛋白水平,降低BAX蛋白水平,抑制视网膜神经细胞的凋亡有关。另外,银杏叶提取物可以增加脑缺血再灌注24 h后BCL-2的表达,降低BAX表达,防止Caspase-3激活,起到脑保护作用[16]。针对缺血性或出血性脑卒中、脑缺血再灌注损伤等疾病的实验研究,还有当归挥发油、西洋参皂苷、虎杖苷、藏花醛、积雪草酸、天麻素、木犀草素、槲皮素、苦参碱、丹参酮、白扁豆多糖、石菖蒲等中药有效成分或提取物均以BAX、BCL-2和/或Caspase-3为靶点抑制神经元凋亡。另外,葛根素改善创伤性脑损伤,白芍总苷、远志总苷等对阿尔茨海默病,天麻多糖对脑瘫,黄芩苷对巨细胞病毒神经系统感染,川芎嗪对脑缺血大鼠的实验研究以及竹节参总皂苷、宁夏无果枸杞叶提取物对衰老小鼠脑组织神经细胞凋亡的实验研究中,其抗神经细胞凋亡的机制均与其降低BAX/BCL-2比值和下调Caspase-3的表达水平有关[17-21]。

2.1.1.2 中药复方 俞睿等[22]发现清脑益元汤(水蛭、水牛角、肉苁蓉、紫河车等)能有效抑制神经细胞凋亡途径的激活,对急性脑缺血损伤具有保护作用,其机制可能与上调BCL-2,下调BAX的表达有关。黄芪丹参1:1配伍、川芎嗪和葛根素配伍以及补阳还五汤、地黄饮子、右归饮、桃红四物汤、安寐丹、活血醒脑方(远志、石菖蒲、黄芪、冰片等)、百事乐加味方(姜黄、柴胡、川芎等)、健脾补土方(四君子汤加减)、健脾益气方(四君子汤加减)、人参首乌方(红参、制何首乌)等常用药对、多种经典方剂、现代验方、中成药,涉及脑卒中、脑缺血再灌注损伤、急性脊髓损伤、抑郁症、癫痫等多种神经系统疾病或基于“脾脑相关”等理论从脑入手治疗脾胃病,多以BCL-2家族蛋白和/或Caspase家族蛋白为靶点研究抗神经细胞凋亡的作用机制[23-32]。

2.1.2 以其他相关凋亡蛋白为靶点

除BCL-2家族和Caspase家族外,p53、c-Fos、NF-κB、Apaf-1等也是参与神经细胞凋亡过程的重要因子。值得注意的是,中药抗神经细胞凋亡的机制并不单一,具有多靶点的控制作用。研究发现,五味子乙素通过抑制凋亡基因p53、Caspase-3、BAX的活化与表达可实现对阿尔茨海默病记忆能力的改善[33]。

一种中药成分通过不同靶点在不同疾病中发挥抗凋亡作用,以黄芪多糖为例。吴丹等[34]对脑外伤大鼠模型腹腔注射黄芪多糖,发现其可能通过增加脑部c-Fos的表达、降低NO含量,抑制大鼠海马神经元凋亡。另外,黄芪多糖能抑制凋亡基因p53,上调脑皮质神经细胞蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)的表达,继而改善脑缺血再灌注大鼠神经功能损伤[35]。屈文英等[36]通过实验发现,黄芪多糖可能通过抑制Caspase-3、Caspase-9及CytC的表达抗神经元凋亡从而改善阿尔茨海默病大鼠的认知功能。黄芪甲苷、红景天苷、芍药苷、人参皂苷Rg1、淫羊藿、仙茅、蜈蚣提取物等抑制NF-κB的活化产生神经保护和抗凋亡作用。毛蕊异黄酮通过调控CytC/Apaf-1凋亡信号通路减轻脑缺血再灌注损伤[37]。

2.2 调控相关激酶

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、JNK等丝氨酸/苏氨酸激酶与神经细胞凋亡密切相关。卢国良等[38]对脊髓压迫损伤型大鼠给予人参皂苷Rg1,发现其能促进p38MAPK、ERK-1/2、JNK、JAK等信号通路的激活,调控BCL-2/BAX的比值,发挥抗凋亡作用,有利于保护神经功能。银杏内酯A、银杏内酯B可能通过降低JNK磷酸化水平,阻断JNK信号通路,发挥抑制脑梗塞大鼠模型脑神经元凋亡的作用[39]。对药酸枣仁、合欢花可能通过PERK/ATF4/CHOP途径,缓解ERS,进而抑制Caspase-12诱导的细胞凋亡,从而改善抑郁症状[40]。

糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)/β-catenin信号通路是多种信号通路的调控枢纽,在神经细胞凋亡过程中发挥关键的转导作用。GSK-3β是β-catenin上游的关键酶,可导致β-catenin的降解复合体失活,磷酸化β-catenin并使其进入细胞核,与T细胞因子/淋巴增强因子结合,诱导细胞凋亡[41]。王彦平等[42]对脑梗死大鼠模型进行石菖蒲药液灌胃,发现石菖蒲抗神经细胞凋亡的机制与抑制GSK-3β/β-catenin信号通路的激活,降低BAX、Caspase-3蛋白表达量有关。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路是经典的细胞存活信号通路,具有抑制细胞凋亡,缓解氧化应激及炎症反应,促进细胞代谢、增殖等作用。中药复方健耳剂保护老年性耳蜗螺旋神经节神经元的机制之一是通过促进脑源性神经生长因子的产生,激活MAPK、PKA/cAMP或PI3K/AKT信号转导途径,抑制ROS产生,阻止Caspase家族介导的细胞凋亡[43]。一项研究发现,姜黄素可通过激活海马区PI3K/AKT信号通路,降低Caspase-3的表达,发挥对海马区神经元的保护作用[44]。另外,灯盏细辛也能通过激活PI3K/AKT通路,降低GSK-3β活性,调控BCL-2/BAX比值,抑制神经元凋亡[45]。

2.3 抗活性氧自由基、炎症细胞因子

大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和炎症细胞因子的产生能够启动神经细胞凋亡程序。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-px)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)等具有抗自由基生成,减轻氧化损伤的作用。研究表明,黄芪总皂苷可以提高脑部血清SOD活性,抑制ROS的产生,减少神经细胞凋亡,对脑缺血再灌注损伤后的脑组织[46]。Bao等[47]发现,丹参酸A能够减少ROS的产生,提高SOD、CAT、GSH-px的活性抑制凋亡途径的激活。王东帆等[48]对自然衰老大鼠腹腔注射三七总皂苷,发现大鼠海马区细胞凋亡数量显著减少,其机制可能与抑制炎症小体NOD样受体蛋白3(nod-like receptor pyrin domain3,NLRP3)的激活,下调内质网通路相关蛋白激酶JNK和CHOP的表达有关。另有研究发现,三七总皂苷、胡黄连苷Ⅱ、厚朴酚、铁皮石斛多糖、血塞通软胶囊等可以降低脑组织中TNF-α炎性因子而发挥神经保护作用[48-49]。姜黄素、银杏叶提取物抑制Janus激酶(janus kinase,JAK)信号转导通路可降低细胞内炎症反应因子抗神经细胞凋亡[50]。

2.4 其他

陈岩岩等[51]从脾入手保护神经细胞,给予脑缺血大鼠加味四君子汤进行干预,其抗神经细胞凋亡的机制可能与增加细胞外基质纤维蛋白-5及p-Akt蛋白的表达有关,二者能共同促进受损神经细胞的修复和再生。另外,低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在持续缺氧时含量增加,能够上调p53的表达水平,促进Caspase-3的活化,诱导神经元凋亡。川陈皮素可以下调脑梗死大鼠HIF-1α,上调VEGF,抑制神经细胞凋亡[52]。党英男等[53]通过研究发现,红景天苷可能通过调控HIF-1α蛋白含量实现抗神经细胞凋亡的作用,从而改善脑缺血-低氧大鼠血流动力学指标。藏药五味沉香散通过降低HIF-1α的表达,提高抗凋亡蛋白BCL-2的表达保护脑组织[54]。

3 结语

我国中药资源丰富且功效显著,探讨中药抗神经细胞凋亡的作用从而提高治疗相关疾病的临床疗效是当今的研究热点。通过对近年来国内外相关文献的整理分析发现如下问题:一、中药成分复杂,其在抗神经细胞凋亡过程中具有多组分、多靶点、多途径的综合作用。另外,中药通过合理配伍也可发挥协调整合作用。二、同一种中药提取物可针对不同靶点在不同疾病中发挥抗凋亡作用,如黄芪多糖、黄芪甲苷、红景天苷、三七总皂苷、姜黄素、银杏叶提取物、石菖蒲等。三、中药抗神经细胞凋亡的作用机制复杂,同一种药不同成分以及不同中药在抗凋亡过程中的相互作用机制尚不清晰。四、目前中药抗神经细胞凋亡机制的研究多集中在对相关凋亡蛋白的研究如BCL-2及Caspase-3,此外,抗氧化及内质网通路的相关研究也逐渐增多。五、中医治疗基于整体观念、辨证论治,目前实验动物模型及药物的应用上虽然有助于从现代药理学角度认识中药,但较少体现中医思维。因此,探索中药有效成分、提取物及中药复方的抗神经细胞凋亡的机制,凸显中医药独特优势还需进一步完善实验设计思路,从而为中西医结合及中药的靶向应用提供理论基础。