“双固一通”电针预处理对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠细胞凋亡的机制研究❋

陈 佳,韩永丽,陈 松,陈子琴,陈 贝,王昆秀,张艳琳,罗志辉,顾骁磊,石炎萍,周 婷,许辛寅

(1.湖北中医药大学针灸骨伤学院,武汉 430061;2.湖北中医药大学第一临床学院,武汉 430061)

急性心肌梗死是全球冠心病患者发病和死亡的主要原因[1-2]。早期冠状动脉再灌注是治疗急性心肌梗死的经典方法,然而,随之而来的再灌注损伤发病机制尚未明确,目前对此仍缺乏有效应对措施[3]。心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)伴随持续的I/R损伤和心肌细胞凋亡,凋亡水平决定了心肌I/R损伤(myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI)的严重程度[4]。前期研究表明“双固一通”针法固护正气,能够提高衰老大鼠抗病能力,对急性心肌梗死细胞具有保护作用,较单纯“内关”针刺方法效果更好[5-11]。本研究拟进一步探究“双固一通”电针预处理在MIRI细胞凋亡中的保护作用及其内在机制。本研究经湖北中医药大学实验动物伦理委员会审查批准,编号:SXDX2019050A。

1 材料与方法

1.1 动物

健康SPF级雄性Wistar大鼠50只,体质量180～220 g,由湖北省医学科学研究院实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(鄂)2020-0018。大鼠饲养于湖北中医药大学标准动物房,环境温度20～24 ℃,相对湿度40%～45%,每日光照10～12 h,自由进食、饮水。

1.2 主要试剂

肌酸激酶心肌型同工酶(creatine kinase isoenzymes,CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)检测试剂盒,货号分别为 H197-1-1、A020-1-1、A015-1-1,购自南京建成生物科技有限公司;RNA提取液(货号G3013)、荧光定量PCR试剂盒(货号G3008),购自武汉赛维尔生物科技有限公司;逆转录试剂盒(货号K1622),由美国Thermo公司提供;抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒(货号K500),购自丹麦Dako Denmark A/S公司;B淋巴细胞瘤(B-cell lymphoma,Bcl)-2兔多抗(货号26593-1-AP)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)兔多抗(货号15422-1-AP),由武汉三鹰生物技术有限公司提供;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cystein-asparate protease,Caspase)-3兔多抗(货号Ab4051),购自英国Abcam公司;miR-133a-3p抑制剂(5′-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3′),由青岛生工生物科技有限公司合成。

A.正常心电图;B.缺血心电图;C.再灌注心电图

1.3 主要仪器

ALC-V8型动物呼吸机,上海奥尔科生物科技有限公司;BL-420S生物机能实验系统,成都泰盟电子有限公司;Chemray420型全自动生化分析仪,深圳雷杜生命科技有限公司;JB-P5型包埋机,武汉俊杰电子有限公司;RM2016型病理切片机,上海徕卡仪器有限公司;Tecnai G2 20 TWIN型透射电子显微镜,美国FEI公司;KZ-Ⅱ型匀浆仪,武汉赛维尔生物科技有限公司;D3024R型台式高速冷冻型微量离心机,北京DragonLab公司;Stepone plus型荧光定量PCR仪,美国ABI公司;NanoDrop2000型超微量分光光度计,美国Thermo公司;XSP-C204型普通光学显微镜,重庆光电仪器有限公司。

1.4 分组

适应性喂养1周后,将所有动物随机分为5组:假手术组(sham group,S组)、模型组(ischemia reperfusion group,I/R组)、电针预处理组(electroacupuncture pretreatment group;EA组)、miR-133-3p抑制剂组(antagomir group,Ant组)与电针预处理+miR-133-3p抑制剂组(EA+Ant组)。每组各10只大鼠。

1.5 预处理

分组后对各组大鼠进行预处理。S组:10只大鼠,每天穿自制鼠衣捆绑20 min,共7 d,第8天开胸后暴露心脏,只穿线不结扎。I/R组:10只大鼠,捆绑方法与时间同S组,第8天开胸后行缺血再灌注造模。EA组:对10只大鼠进行电针预处理,穿自制鼠衣,参照华兴邦等[12]制定的《大鼠穴位图谱的研制》取穴,在前肢内侧离腕关节约3 mm处的尺桡骨缝间取双侧“内关(PC6)”,用0.30 mm×15 mm毫针针刺双侧穴位,针刺深度约5 mm;在膝关节后外侧、腓骨小头下约5 mm处取双侧“足三里(ST36)”,针刺深度约7 mm;在脐下约25 mm处取“关元(RN4)”,针刺深度约2 mm;接HANS-200电针治疗仪,采用连续波,强度为1 mA,频率2 Hz,每天通电20 min,连续治疗7 d,第8天行缺血再灌注术。Ant组:10只大鼠,捆绑方法同I/R组,共7 d,从第5天起连续3 d经尾静脉注射miR-133-3p抑制剂(80 mg/kg),第8天行缺血再灌注术。EA+Ant组:同时进行电针预处理和miR-133-3p抑制剂预处理,方法同上。

1.6 造模

采用物理结扎法加推管法创建在体MIRI模型[13]。各组大鼠均采用2%戊巴比妥钠溶液(40 mg/kg)腹腔注射,麻醉后放置在手术台上,心电监测,行气管切开术后插管接呼吸机(潮气量40,呼吸比1:2,呼吸频率50次/min)。大鼠左侧胸骨第3、4肋间横消毒后切开皮肤,依次钝性分离各层组织,暴露心脏。除S组外,各组大鼠均于左心耳下2～3 mm处结扎前降支冠状动脉造成心肌缺血模型,缺血20 min后再灌注40 min,建立MIRI模型。大鼠缺血过程中缺血标志为左室前壁向外膨胀及心电图ST段抬高,进行再灌注时再灌注成功标志为左室前壁缺血区紫色消失,抬高的ST段下降1/2。S组大鼠用丝线穿过前降支冠状动脉但不结扎。造模成功后立刻将各组大鼠麻醉处死取材。

1.7 指标检测

1.7.1 心电监测 通过BL-420S生物机能实验系统记录造模过程中I/R组、EA组、Ant组、EA+Ant组大鼠的心电图。

1.7.2 血清生化检测 取大鼠腹主动脉血5 mL,离心后取上清,采用全自动生化分析仪检测血清CK-MB、LDH、T-AOC水平。

1.7.3 电镜 每组3只大鼠,在梗死区域取约1 mm×1 mm×1 mm大小的心肌组织,固定、漂洗、脱水、石蜡嵌入、切片后采用透射电镜观察各组大鼠梗死心肌的超微结构。

1.7.4 荧光定量PCR 每组3只大鼠,取心脏前降支冠状动脉结扎处约100 mg梗死组织,提取总RNA,再反转录为cDNA,以cDNA为模板定量扩增目的基因Bax、Caspase-3、Bcl-2、丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MKK)3、MKK6、p38MAPK与内参基因GAPDH,用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.7.5 免疫组化 每组取4只大鼠,将其梗死的心肌组织(组织取法参照荧光定量PCR)用4%多聚甲醛固定,切片梯度水化、润洗后抗原修复,苏木精染色,脱水,树脂封片。观察各组大鼠心肌梗死组织Bax、Caspase-3及Bcl-2表达。用Image-Pro 6.0图像分析系统分析阳性产物的积分光密度(integral optical density,IOD)值。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠心电图

为了验证模型是否成功,对I/R组、EA组、Ant组、EA+Ant组大鼠进行心电图检测,心电图对应造模过程不同的阶段(图1)。结果显示:心肌缺血时可见大鼠ST段抬高,再灌注时ST段下降1/2,说明心肌缺血再灌注模型制造成功。

2.2 各组大鼠血清CK-MB、LDH、T-AOC水平

血清中CK-MB、LDH的含量可直接反映心肌细胞受损程度,T-AOC可反映机体抗氧化能力。与S组比较,I/R组大鼠血清中CK-MB和LDH水平增加,T-AOC水平降低(P<0.05)。与I/R组比较,EA组、Ant组、EA+Ant组大鼠血清中CK-MB和LDH水平降低,T-AOC水平升高(P<0.05),提示电针可减轻I/R模型大鼠心肌损伤。与EA组比较,Ant组、EA+Ant组大鼠血清中CK-MB水平升高、T-AOC水平降低(P<0.05)。Ant组和EA+Ant组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2。

注:与S组比较*P<0.05;与I/R组比较#P<0.05;与EA组比较△P<0.05;肌酸激酶同工酶(CK-MB),乳酸脱氢酶(LDH),血清总抗氧化能力(T-AOC);S.假手术组; I/R.模型组; EA.电针预处理组; A.miR-133-3p抑制剂组; EA+Ant.电针预处理+miR-133-3p抑制剂组

62.3 各组大鼠心肌梗死区超微结构

S组大鼠心肌纤维基本正常,肌丝分布均匀、排列整齐,线粒体结构清晰、无水肿。I/R组模型大鼠心肌损伤严重,肌纤维排列紊乱,部分肌丝溶解、坏死,线粒体结构紊乱,形状不规则。EA组、Ant组、EA+Ant组大鼠心肌纤维排列较整齐,可见清晰肌小节,心肌细胞轻微肿胀,轻度空化,线粒体结构基本完整,小部分线粒体仍存在空泡样改变,提示电针可减轻I/R模型大鼠心肌损伤。见图3。

注:黑色箭头示线粒体;S.假手术组; I/R.模型组; EA.电针预处理组; Ant.miR-133-3p抑制剂组; EA+Ant.电针预处理+miR-133-3p抑制剂组

2.4 各组大鼠心肌梗死区Bax、Caspase-3、Bcl-2 mRNA表达

为进一步探讨电针保护MIRI的作用机制,采用荧光定量PCR检测心肌梗死组织Bax、Caspase-3和Bcl-2 mRNA表达。与S组比较,I/R组大鼠心肌梗死组织Bax、Caspase-3 mRNA表达水平增加,Bcl-2 mRNA表达水平降低(P<0.05)。与I/R组比较,EA组、Ant组、EA+Ant组大鼠心肌梗死组织Bax、Caspase-3 mRNA表达水平降低,Bcl-2 mRNA表达水平升高(P<0.05)。与EA组比较,Ant组、EA+Ant组大鼠心肌梗死组织Bax、Caspase-3 mRNA表达水平增加,Ant组大鼠心肌梗死组织Bcl-2 mRNA表达水平降低(P<0.05),提示EA可能通过降低Bax、Caspase-3表达,升高Bcl-2表达对MIRI起保护作用。Ant组和EA+Ant组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图4。

注:与S组比较*P<0.05;与I/R组比较#P<0.05;与EA组比较△P<0.05,Bcl-2相关X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3); B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)S.假手术组;I/R.模型组;EA.电针预处理组;Ant.miR-133-3p抑制剂组;EA+Ant.电针预处理+miR-133-3p抑制剂组

2.5 各组大鼠心肌梗死区Bax、Caspase-3及Bcl-2阳性表达IOD值

通过免疫组化染色观察Bax、Caspase-3和Bcl-2的表达,用IOD值量化阳性产物染色强度,探讨电针预处理抗心肌细胞凋亡机制。S组大鼠心肌梗死组织Bax、Caspase-3表达不明显,Bcl-2高表达。与S组比较,I/R组大鼠心肌梗死组织Bax、Caspase-3表达增强,Bcl-2表达减弱(P<0.05)。与I/R组比较,EA组、Ant组、EA+Ant组大鼠心肌梗死组织Bax、Caspase-3表达减弱,Bcl-2表达增强(P<0.05)。与EA组比较,Ant组、EA+Ant组大鼠心肌梗死组织Bax、Caspase-3表达增强,Bcl-2表达减弱(P<0.05)。Ant组和EA+Ant组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图5。

注:与S组比较*P<0.05;与I/R组比较#P<0.05;与EA组比较△P<0.05; B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),积分光密度(IOD);S.假手术组;I/R.模型组;EA.电针预处理组;Ant.miR-133-3p抑制剂组;EA+Ant.电针预处理+miR-133-3p抑制剂组

2.6 各组大鼠心肌梗死区MKK3、MKK6、p38MAPK mRNA表达

为了阐明电针对MIRI的作用机制,采用荧光定量PCR检测各组大鼠心肌梗死区MKK3、MKK6、p38MAPK的mRNA表达水平。与S组比较,I/R组大鼠心肌梗死组织MKK3、MKK6、p38MAPK mRNA表达水平增加(P<0.05)。与I/R组比较,EA组、Ant组、EA+Ant组大鼠心肌梗死组织MKK3、MKK6、p38MAPK mRNA表达水平降低(P<0.05)。与EA组比较,Ant组、EA+Ant组大鼠心肌梗死组织MKK3、MKK6、p38MAPK mRNA表达水平增加(P<0.05),提示EA可能通过抑制MKK3、MKK6、p38MAPK表达保护MIRI模型大鼠。Ant组和EA+Ant组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图6。

注:与S组比较*P<0.05;与I/R组比较#P<0.05;与EA组比较△P<0.05;S.假手术组;I/R.模型组;EA.电针预处理组;Ant.miR-133-3p抑制剂组;EA+Ant.电针预处理+miR-133-3p抑制剂组

3 讨论

MIRI的病机包括气虚、血瘀、痰饮,其中气虚为本,血瘀痰饮为标,形成恶性循环,故治疗时当标本兼顾,可选用“双固一通”针法[14]。“双固”取“关元”“足三里”以固先后天之本,振奋一身阳气,“一通”选“内关”以通经泻邪[15]。本研究通过心肌I/R大鼠模型验证了“双固一通”电针预处理可有效改善MIRI,且具体机制与抑制细胞凋亡相关。

p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38 MAPK)在MIRI中发挥重要作用[16],它是I/R后心肌细胞凋亡信号转导的关键因素[17]。p38MAPK是有丝分裂原激活的蛋白激酶的4个特征性亚家族成员之一,可被多种应激刺激激活,激活后的p38MAPK可调控下游多种酶及转录因子[18]。先前的研究表明,电针可通过抑制p38MAPK通路减轻I/R过程中的炎症损伤来改善MIRI[19]。p38MAPK通路的上游激活物是MKK3/4/6,其中MKK3、MKK6仅特异性激活p38MAPK[20]。在本研究中,电针预处理可降低MKK3、MKK6、p38MAPK表达,说明电针预处理可能通过抑制MKK3/6-p38MAPK通路改善MIRI。研究表明,I/R过程中细胞凋亡途径异常激活[21]。细胞凋亡常伴随着促凋亡蛋白Bax的增加和抗凋亡蛋白Bcl-2的减少。细胞色素C从线粒体释放到细胞质是凋亡途径之一,促使裂解的Caspase-3激活,从而导致细胞凋亡[22]。p38MAPK抑制剂能通过Ras同源基因家族成员(Ras homolog gene family member,Rho)A有效抑制心肌细胞早期凋亡,降低Bax、caspase-3水平,上调Bcl-2[23]。RhoA可调节MKK3、MKK6和p38MAPK的磷酸化水平[24-25]。p38MAPK、RhoA均与凋亡关系密切[26]。p38MAPK相关联的信号通路都可能与RhoA有直接或间接的联系[27]。miR-133a-3p是miR-133a的重要组成部分[28],在心肌缺血处理中抑制caspase-3的表达,促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达[29-34]。RhoA是miR-133的潜在调控靶点,上调miR-133水平可调控RhoA表达[35-36]。在本研究中,电针预处理可抑制MKK3、MKK6、p38MAPK表达,下调Bax、Caspase-3表达,上调Bcl-2表达,说明电针预处理可能通过调节MKK3/MKK6-p38MAPK通路改善心肌细胞凋亡。研究结果提示单纯抑制剂亦可通过抑制MKK3/MKK6-p38MAPK通路改善心肌细胞凋亡,而电针预处理+抑制剂的干预效果却低于电针预处理。因此,推测电针预处理能够通过miR-133a-3p-MKK3/MKK6-p38MAPK通路抑制细胞凋亡,并计划在以后的研究中进一步探讨电针预处理调控miR-133a-3p相关通路的具体机制。

综上所述,“双固一通”电针预处理可能通过调节miR-133a-3p-MKK3/MKK6-p38MAPK通路以抑制细胞凋亡,从而改善MIRI。