基于黄酮合成通路基因表达特性的木薯对二斑叶螨防御机理初探

乔阳 梁晓 陈青 伍春玲 刘迎 刘小强 税军 姚晓文

关键词：二斑叶螨；抗、感螨木薯品种；黄酮合成通路；基因表达

木薯（ManihotesculentaCrantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot）作物，原产于亚马逊南部盆地，目前广泛种植于全球亚热带和热带地区[1]，具有高产、高淀粉含量、耐贫耐旱等特点[2]，为世界上100多个国家近10亿人口提供碳水化合物来源[3]。木薯还是重要的工业原料、能源作物、饲料作物和救荒作物，在淀粉糖合成、医药、化工、造纸和食品等领域发挥重要作用[4-5]。

二斑叶螨（TetranychusurticaeKoch）是世界危险性害螨，是危害木薯最严重的四大有害生物之一[6]，其严重为害会使木薯减产50%～70%，甚至绝收[7]。目前，化学杀螨剂依然是控制二斑叶螨最常用的方法，但该螨于木薯种植后6～8个月暴发成灾，而此时木薯地已封行，不仅导致药剂的有效利用率降低，还将造成害螨抗药水平上升，产品和产地环境安全风险加剧等问题[8-9]。因此，寻求绿色、高效、环境友好的害虫防治策略才能够有效支撑木薯产业的可持续发展。

抗虫品种的选育与利用是实现害虫绿色综合防控的重要手段[10-11]，研究作物抗虫机理能为抗虫品种的选育提供重要的理论依据。研究表明，植物能产生多种次生代谢物来防御生物和非生物胁迫[12-13]，其中，黄酮类化合物在作物形成抗虫性中发挥重要作用[14]，它可以抑制昆虫的摄食、发育和产卵[15]，黄酮类化合物及其合成调控基因的抗虫作用已见于玉米抗棉铃虫（HelicoverpaarmigeraHübner）、茶树抗茶尺蠖（EctropisobliquaProut）、水稻抗褐飞虱（NilaparvatalugensStal）等相关研究[16-18]。然而迄今为止，尚未见黄酮合成通路基因在木薯抗二斑叶螨中的功能报道。因此，本研究拟分析比较二斑叶螨取食不同抗性水平木薯品种前后黄酮合成通路基因的表达量差异，以初步明确与木薯抗二斑叶螨相关的黄酮合成通路关键基因，为深入开展基于黄酮代谢通路的抗螨木薯新种质的创制与分子设计育种提供重要的理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试二斑叶螨参考伍牧锋等[19]的方法进行二斑叶螨的室内饲养。选择发育历期相同、大小一致的雌成螨进行试验。

1.1.2供试木薯遗传稳定的抗螨木薯品种C1115、缅甸（Myanmar）、SC9，感螨木薯品种SC205、面包（Bread）、BRA900[20]由中国热农业科学院热带作物品种资源研究所国家木薯种质资源圃提供。参考韩志玲等[21]的方法进行木薯的室内种植，待木薯生长约60d后，选择长势一致的健康木薯植株进行害螨接种。

1.1.3候选黄酮合成通路基因根据KEGG网站（https：//www.kegg.jp/kegg/）中已发布的黄酮类代谢物合成通路，绘制木薯黄酮类代谢物合成通路示意圖（图1），选取植物黄酮合成调控研究中最为广泛的7个基因作为候选基因，分别为CHS（查尔酮合酶）、PGT1（根皮苷合酶）、C3'H（5-O-香豆酰基-D-喹啉3'-单加氧酶）、FLS（黄酮醇合酶）、F3H（柚皮素3-双加氧酶）、LAR（白花青素还原酶）、CYP93B_16（黄酮合酶II）。

1.2方法

1.2.1二斑叶螨接种与取样分别选取室内种植60d，长势一致，健康的抗螨木薯品种C1115、缅甸（Myanmar）、SC9，感螨木薯品种SC205、面包（Bread）、BRA900进行害螨接种。每株木薯分别选取中部的3张叶片，用实验室自制的吸虫器小心吸取发育一致的二斑叶螨雌成螨，接种于叶背面（50头/片），并以羊毛脂涂抹在叶柄基部以防止二斑叶螨逃逸。采集未受螨害（0d）、螨害1、4d后的叶片用于RNA提取。不同木薯品种不同螨害时间处理均设置3个生物学重复。

1.2.2RNA提取及cDNA第一条链的合成参照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN，美国）说明书提取木薯叶片RNA，取去除gDNA后的RNA样品1.0μg进行cDNA第一链的合成，合成方法参照RTEasyMixforqPCR试剂盒（TOLOBIO，中国）。

1.2.3实时荧光定量PCR分析根据GenBank中已经发布的木薯黄酮类代谢物合成通路7个关键基因序列设计qPCR引物（表1）。cDNA样品经RNase-freeddH2O稀释160倍后作为qPCR的模板，以木薯Meactin为内参基因[7]。qPCR反应体系的配制参照2×Q3SYBRqPCRMasterMix试剂盒（TOLOBIO，中国）。qPCR反应条件为95℃30s；95℃10s，60℃30s，40个循环。使用LightCycler?96仪器（Roche，瑞士）默认溶解曲线程序采集溶解曲线。根据LIVAK等[22]的2-ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt2-ΔCt1，ΔCt1为2个样本内参基因Ct值的差值，ΔCt2为2个样本目的基因Ct值的差值）方法计算而得，每个处理均设置3个重复，目的基因在2个样本间的相对表达量为3个重复的平均值。

1.3数据处理

采用Excel和GradphadPrism软件进行数据汇总整理，使用SPSSStatistics24软件进行数据分析，采用Duncans新复极差法进行数据间的多重比较，采用皮尔逊相关性分析（Personscorrelationanalysis）方法分析基因表达量和木薯品种螨害指数间的相关性，其中螨害指数用于表征木薯品种的抗螨水平，前期研究结果表明，抗螨木薯品种C1115、SC9和Myanmar的螨害指数分别为12.50、26.60和14.40，感螨木薯品种Bread、SC205和BRA900的螨害指数分别为95.40、93.60和95.70[20]。

2结果与分析

2.1二斑叶螨取食前后抗、感螨木薯品种叶组织中CHS基因表达差异分析

比较螨害前后同一木薯品种的CHS基因相对表达量发现，与螨害前相比，感螨木薯品种Bread、SC205和BAR900的CHS基因表达量呈先显著降低再显著升高的趋势，而抗螨木薯品种C1115、SC9和Myanmar的CHS相对表达量呈先显著升高再显著降低的趋势（图2A）。

比较螨害前后抗、感螨品种间CHS的表达量发现，螨害4d后，抗螨木薯品种中CHS的表达量总体上高于感螨木薯品种，而螨害1d后，抗螨木薯品种中CHS的表达量均显著高于感螨木薯品种（图2B）。进一步相关性分析表明（以螨害1d后数据进行分析），螨害后CHS基因的相对表达量与木薯品种抗螨性呈正相关（r=0.8684，P=0.012）。

2.2二斑叶螨取食前后抗、感木薯品种叶组织中的PGT1基因表达差异分析

比较螨害前后同一木薯品种的PGT1基因相对表达量发现，与螨害前相比，感螨木薯品种Bread、SC205和BAR900的PGT1基因表达量呈先显著降低再显著升高的趋势，而抗螨木薯品种C1115、SC9和Myanmar的PGT1相对表达量呈先升高再显著降低的趋势（图3A）。

比较螨害前后抗、感螨品种间PGT1的表达量发现，螨害前（0d），抗螨木薯品种中PGT1的表达量总体上高于感螨木薯品种，而螨害1d后，抗螨木薯品种中PGT1的表达量均显著高于感螨木薯品种（图3B），进一步相关性分析结果表明（以螨害1d后数据进行分析），螨害后PGT1基因相对表达量与木薯品种抗螨性呈正相关（r=0.9891，P=0.0001）。

比较螨害前后抗、感螨品种间F3H的表达量发现，螨害前（0d），抗、感木薯品种间F3H基因表达量差异不显著，但抗螨木薯品种C1115的F3H表达量显著高于其他品种，螨害4d后，抗螨木薯品种中F3H的表达量总体上高于感螨木薯品种。而螨害1d后，抗螨木薯品种C1115、SC9和Myanmar的F3H表達量均显著高于感螨木薯品种（图4B）。进一步相关性分析结果表明（以螨害1d后数据进行分析），螨害后F3H基因相对表达量与木薯品种抗螨性呈正相关（r=0.6438，P=0.084）。

2.3二斑叶螨取食前后抗、感木薯品种叶组织中的F3H基因表达差异分析

比较螨害前后同一木薯品种的F3H基因相对表达量发现，与螨害前相比，感螨木薯品种Bread、SC205和BAR900的F3H基因表达量呈先显著降低再升高的趋势，而抗螨木薯品种SC9和Myanmar的F3H基因相对表达量呈先显著升高再显著降低的趋势，C1115的F3H基因相对表达量则呈显著降低的趋势（图4A）。

2.4二斑叶螨取食前后抗、感木薯品种叶组织中的FLS基因表达差异分析

比较螨害前后同一木薯品种的FLS基因相对表达量发现，与螨害前相比，感螨木薯品种Bread、SC205和BAR900的FLS基因表达量呈逐渐降低的趋势，而抗螨木薯品种C1115、SC9和Myanmar的FLS相对表达量呈先显著升高再降低的趋势（图5A）。

比较螨害前后抗、感螨品种间FLS的表达量发现，螨害4d后，抗螨木薯品种中FLS的表达量总体上高于感螨木薯品种，而螨害1d后，抗螨木薯品种的FLS表达量均显著高于感螨木薯品种（图5B）。进一步相关性分析结果表明（以螨害1d后数据进行分析），螨害后FLS基因相对表达量与木薯品种抗螨性呈正相关（r=0.8073，P=0.026）。

2.5二斑叶螨取食前后抗、感木薯品种叶组织中的LAR基因表达差异分析

比较螨害前后同一木薯品种的LAR基因相对表达量发现，与螨害前相比，感螨木薯品种Bread和SC205的LAR基因表达量呈先降低再升高的趋势，BAR900的LAR基因相对表达量呈升高的趋势。抗螨木薯品种SC9和Myanmar的LAR基因相对表达量呈先显著升高再降低的趋势，而C1115的LAR基因相对表达量呈降低趋势（图6A）。

比较螨害前后抗、感螨品种间LAR的表达量发现，螨害1d后，抗螨木薯品种SC9和Myanmar的LAR基因相对表达量均显著高于各感螨木薯品种，而C1115的LAR基因相对表达量与感螨木薯之间无显著差异（图6B）。进一步相关性分析结果表明（以螨害1d后数据进行分析），螨害后LAR基因相对表达量与木薯品种抗螨性呈正相关（r=0.5722，P=0.118）。

2.6二斑叶螨取食前后抗、感木薯品种叶组织中的C3'H基因表达差异分析

比较螨害前后同一木薯品种的C3'H基因相对表达量发现，与螨害前相比，感螨木薯品种Bread和BAR900的C3'H基因相对表达量呈先显著降低再显著升高的趋势，SC205的C3H基因相对表达量呈升高趋势，抗螨木薯品种SC9和Myanmar的C3'H基因相对表达量呈先显著升高再显著降低的趋势，而C1115的C3'H基因相对表达量无显著变化（图7A）。

比较螨害前后抗、感螨品种间C3'H的表达量发现，螨害前（0d），抗螨木薯品种中C3'H的表达量总体高于感螨木薯品种，而螨害1d后，抗螨木薯品种中C3'H的表达量均高于感螨木薯品种（图7B）。进一步相关性分析结果表明（以螨害1d后数据进行分析），螨害后C3'H基因相对表达量与木薯品种抗螨性呈正相关（r=0.7704，P=0.037）。

2.7二斑叶螨取食前后抗、感木薯品种叶组织中的CYP93B_16基因表达差异分析

比较螨害前后同一木薯品种的CYP93B_16基因相对表达量发现，与螨害前相比，感螨木薯品种Bread、SC205和BAR900的CYP93B_16基因表达量呈先显著降低再显著升高的趋势，而抗螨木薯品种SC9和Myanmar的CYP93B_16相对表达量呈先升高再显著降低的趋势，C1115的CYP93B_16基因相对表达量呈显著下降的趋势（图8A）。

比较螨害前后抗、感螨品种间CYP93B_16的表达量发现，螨害1d后，抗螨木薯品种SC9和Myanmar的CYP93B_16基因相对表达量均显著高于各感螨木薯品种，而C1115的CYP93B_16基因相对表达量与感螨木薯之间无显著差异（图8B）。进一步相关性分析结果表明（以螨害1d后数据进行分析），螨害后CYP93B_16基因相对表达量与木薯品种抗螨性呈正相关（r=0.6250，P=0.092）。

3讨论

黄酮类化合物广泛存在于植物体内，并且在抵御虫害胁迫中发挥着重要作用[23]。体内分析研究表明，植物中的黄酮类化合物，如儿茶素、山奈酚和芦丁可以影响害虫的取食偏好和产卵[24-26]。落葵中的芹菜素和牡荆素可以抑制斜纹夜蛾（SpodopteralituraFabricius）幼虫的生长发育[27]。绿原酸、槲皮素和阿魏酸等提高了花生对棉铃虫（Helicoverpaarmigera）和蚜虫（AphiscraccivoraKoch）的抗性[28]。紫杉叶素和儿茶素在云杉防御树皮甲虫（Ipstypographus）中发挥重要作用[29]。槲皮素和芦丁可以影响蚜虫的口针刺吸植物的汁液[30]。通过对39个水稻品种对褐飞虱的抗性分析结果表明，黄酮类化合物含量的提高与水稻抗褐飞虱能力的增强有关[31]。体外分析结果表明，在人工饲料中掺入黄酮类化合物也会极大地影响昆虫的生长和发育。如在较高浓度的槲皮素和绿原酸的饲喂处理下，美国白蛾（Hyphantriacunea）的死亡率分别达到了70.00%和67.50%[32]。将柚皮素和槲皮素添加到豌豆蚜（Acyrthosiphonpisum）的人工饲料中，显著降低了蚜虫的繁殖力，并显著增加了其发育历期和成虫的死亡率[33]。

黃酮类化合物在植物体内的积累及转化受其合成基因的调控，因此，黄酮合成通路基因的表达与植物抗虫性有关。黄酮合成通路基因F3H、C4H和F3'5'H在马尾松被松茸毒蛾（DasychiraaxuthaCollenette）和松毛虫（Dendrolimus）为害时快速表达，提高了马尾松的抗虫性[34]。拟南芥的花青素和黄酮醇的合成受MYB转录因子的调控，在拟南芥中过表达MYB75导致花青素和黄酮醇水平增加，可以增强拟南芥对鳞翅目害虫的抗性[15]。转F3H基因水稻对褐飞虱（Nilaparvatalugens）和白背飞虱（SogatellafurciferaHorváth）的抗性显著高于野生型水稻，遗传分析发现F3H基因可以通过影响FLS和DFR的表达量，调控山奈酚、槲皮素和花青素的含量进而影响水稻的抗虫性[35]。前期研究发现，二斑叶螨为害后，抗螨木薯中黄酮合成基因MeLAR和MeANR的表达量，LAR和ANR酶活以及缩合单宁含量均显著高于感螨木薯品种，进一步在感螨野生型木薯中过表达MeLAR和MeANR基因，可以显著提高木薯对二斑叶螨的抗性，从分子水平证明了这2个黄酮合成基因的抗螨功能[36]。然而，木薯中涉及黄酮合成的基因有多个，筛选并验证具有调控黄酮类化合物含量的关键基因及其功能，能够有效支撑抗螨木薯种质分子精准设计育种工作，而明确抗、感螨木薯品种中黄酮合成通路基因的表达差异，能够为候选基因的筛选提供理论依据。

本研究初步揭示了较短的螨害时间内，木薯黄酮类代谢物合成通路调控基因CHS、PGT1、F3H、FLS、LAR、C3'H和CYP93B_16在感螨木薯品种中，受螨害后黄酮合成基因的表达量总体呈先降低（1d）再升高（4d）至螨害前（0d）水平的趋势，其螨害期间的基因表达水平较螨害前并未提高，而抗螨木薯品种中黄酮合成基因的表达量总体呈先显著升高（1d）再降低（4d）的趋势，但均显著高于螨害前（0d）的水平，研究表明，抗螨木薯中基因诱导上调表达的能力强于感螨木薯。进一步比较螨害前后抗、感螨木薯品种黄酮合成通路基因表达量发现，抗螨木薯品种显著高于感螨木薯品种。害虫为害后，抗虫品种中黄酮合成通路基因的防御响应速度和表达量均显著高于感虫作物品种的现象在大豆与二斑叶螨互作[37]，高粱与玉米蚜（RhopalosiphummaidisFitch）互作[38]和水稻与飞虱互作[35]的研究中均有报道，这与本研究结果具有一致性。黄酮合成通路C3'H基因可调控绿原酸的合成，而外施绿原酸可以提高害虫的死亡率[32]，CHS、PGT1和CYP93B_16基因分别调控根皮素、根皮苷和木犀草素的合成，因此，推测抗螨木薯品种受螨害后，可能通过诱导上述黄酮合成基因的上调，从而增加具有抗虫功能的黄酮类代谢物含量以增强其抗螨水平。后续研究可通过干预上述基因的表达，构建转基因木薯株系，以期直接验证上述基因及其调控的黄酮类物质在木薯抗虫性中的功能。

本研究一方面初步阐明了木薯中黄酮合成通路基因可能具有抗螨性功能，另一方面表明上述基因可能具有作为鉴定评价木薯抗螨性水平的分子指标的潜力。但必须指出的是，本研究仅从黄酮类代谢物合成通路基因转录水平初步阐述了木薯对二斑叶螨的抗性机制，而二斑叶螨为害前后，不同抗螨木薯品种的黄酮类代谢物合成通路关键酶和类黄酮物质含量差异尚未进行测定，其转录水平、酶学水平和代谢水平是否具有一致性，以及其抗螨分子功能仍需后续研究进一步证实。