不同温型巨大侧耳菌株的生物学特性及液体发酵条件研究

李婧怡 骈永茹 严廷良 杨阳 李勤奋 李玉

关键词：巨大侧耳；不同温型；营养需求；生长条件；生物量

巨大侧耳[Pleurotusgiganteus（Berk.）Karun.&K.D.Hyde]，又名大杯蕈、巨大香菇、猪肚菇，是国内新开发的一种珍稀食药用菌[1-2]。其营养丰富、口味独特，具有抗肿瘤、抗氧化、降低肝损伤等多种药用功能，备受消费者青睐，具有较高的潜在市场价值[3]。巨大侧耳的纤维素降解能力强、环境适应性高、栽培技术相对简单，逐步引起食用菌生产者的重视，其栽培规模不断扩大，目前已涵盖浙江、山东、北京、上海、云南、广东、福建、海南等多个省（市）[4]。热带地区年平均气温较高，对食用菌出菇温度要求严格，但多数食药用菌属于中低温型，如双孢菇（16～18℃）[5]、金针菇（10～15℃）[6]、黑木耳（20～25℃）[7]等，适合热区规模化栽培的食用菌种类相对较少。研究发现，野生巨大侧耳多于夏末秋初的炎热季节出现，主要分布于我国华中、华南地区，以及东南亚和大洋洲等热带及亚热带地区，人工栽培时也适宜在气温较高的夏季出菇，对于解决食用菌生产淡季和调节市场供应具有一定意义，特别是为热区食用菌产业发展提供新机遇[8]。

种质资源是食用菌研究的基础，高质量的菌种在食用菌产业中至关重要[9]。近年来，随着温室效应的不断加剧，高温已成为限制食用菌在热区栽培的主要因素，耐高温菌株的选育十分迫切。课题组通过前期在热区进行巨大侧耳的规模化栽培，筛选到2株具有不同出菇温型的巨大侧耳菌株，中温型菌株PG79的适宜出菇温度为22～24℃，适合热区的凉季（干季）栽培；高温型菌株PG46可耐受25℃以上高温，适宜出菇温度为26～30℃，适合热区的热季（湿季）栽培。不同温型巨大侧耳菌株的获得，为我国热区全年栽培巨大侧耳提供了宝贵材料。

菌丝阶段是食用菌生长发育的重要阶段，菌丝体培养质量的优劣直接影响食用菌出菇产量的高低[10]。因此，探究2株不同温型巨大侧耳菌丝体生长的营养需求和环境条件，对巨大侧耳的扩大化培养和稳定栽培至关重要。本研究采用单因素和正交试验的方法，对不同温型巨大侧耳菌株进行生物学特性分析和液体发酵条件优化，并对液体发酵中菌丝体生长的动态变化规律进行研究，旨在获得巨大侧耳菌丝体生长的最佳培养基配方和培养条件，以及不同温型菌株间的营养需求和生長条件差异。研究结果可为巨大侧耳的规模化栽培奠定基础，进而推动热区食用菌产业的快速发展。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株实验室通过前期在热区进行规模化栽培，筛选到2株不同温型的巨大侧耳菌株，分别为高温型菌株PG46，中温型菌株PG79，菌种现保存于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所菌种保藏中心。

1.1.2供试培养基使用的基础培养基配方为：葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，加水混匀后定容至1L。

1.2方法

1.2.1生物学特性分析取4℃试管斜面保存的菌种，接种于基础培养基平板上进行活化，28℃恒温暗培养至菌丝长至平板直径的3/4，用于后续试验。

（1）碳源对菌丝体生长的影响。分别以可溶性淀粉、蔗糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖为碳源，以不加碳源为对照。用直径8mm的无菌蓝枪头在已活化菌落边缘打孔取菌块，将菌块接种至碳源培养基正中央，28℃恒温暗培养至菌丝长满平板，每个处理设3次重复。采用“十”字交叉法，每隔24h测量记录菌落直径，并拍照观察。

（2）氮源对菌丝体生长的影响。分别以酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵和氯化铵为氮源，以不加氮源为对照。方法同1.2.1-（1）。

（3）温度对菌丝体生长的影响。以基础培养基为供试培养基，按照1.2.1-（1）接种后，分别置于15、20、25、30、35、40℃培养箱恒温暗培养，分析适宜菌丝体生长的温度范围。然后，在适宜温度范围内划分为20、23、25、28、30℃，明确菌丝体最适生长温度。测量方法同1.2.1-（1）。

（4）pH对菌丝体生长的影响。以基础培养基为供试培养基，用1mol/LHCL和1mol/LNaOH调节培养基pH为5、6、7、8、9，自然pH为对照。方法同1.2.1-（1）。

（5）正交试验。基于单因素试验结果，分别从各因素中选取3个长势最好的培养条件，组成4因素3水平的正交试验，对培养条件进行验证和优化。方法同1.2.1-（1）。

1.2.2液体发酵条件优化基于生物学特性试验，在PG46和PG79的最适培养条件下，开展巨大侧耳液体发酵的最适装液量、转速和接种量探究试验，并探究菌丝动态生长规律[11-12]。

（1）装液量试验。配制液体培养基时，在250mL三角瓶中，分别加入80、100、120、150、180、200mL培养基。高温灭菌后，调节pH为7，每瓶接入10片直径5mm的菌块，置于摇床中恒温暗培养，设置转速150r/min，温度28℃。培养10d后，烘干称菌丝体干重。

（2）转速试验。在250mL三角瓶中加入120mL培养基，接种后分别置于转速为100、120、150、180、200r/min的摇床中培养10d。方法同1.2.2-（1）。

（3）接种量试验。在250mL三角瓶中加入120mL的培养基，分别设置6%、8%、10%、12%、15%的接种量，置于150r/min摇床振荡培养10d。方法同1.2.2-（1）。

（4）生物量动态检测。以干重法测生物量。在液体发酵条件优化的基础上，分别以120mL装液量（250mL三角瓶）、150r/min转速和12%接种量为最适条件，进行液体发酵。从发酵第3天开始，每隔2d取样进行烘干称重，直至菌丝体的干重趋于平稳为止，菌丝干重即为菌丝生物量。方法同1.2.2-（1）。

1.3数据处理

利用SPSS26软件对试验数据进行统计分析[13-15]。

2结果与分析

2.1生物学特性分析

2.1.1碳源对菌丝体生长的影响由图1可知，PG46和PG79在5种供试碳源上均可生长。以麦芽糖为碳源时，2株菌的菌落形态规则，菌丝较浓密且生长速度最大，分别为0.41、0.38cm/d；以可溶性淀粉为碳源时，2株菌的菌丝生长速度较快，但菌落形态不规则；以果糖和葡萄糖为碳源时，PG46菌丝生长速度较快且菌落规则，但PG79菌丝的生长速度较慢且菌落不规则。综上，2株巨大侧耳的最适碳源均为麦芽糖，但以单糖为碳源时，2株菌的利用效果存在差异。

2.1.2氮源对菌丝体生长的影响由图2可知，PG46和PG79在5种供试氮源上均可生长，但生长速度和长势存在显著差异。以酵母浸粉和蛋白胨为氮源时，菌落形态规则，菌丝浓密且生长速度最快，分别为0.39cm/d和0.37cm/d（PG46）、0.41cm/d和0.42cm/d（PG79）；以硫酸铵、氯化铵和尿素为氮源时，菌落形态均不规则且长势较差；不添加氮源时，菌丝生长速度虽较快，但均为气生菌丝且接近透明，不适宜菌丝生长。综上，2株巨大侧耳的最适氮源相同，均为酵母浸粉和蛋白胨。

2.1.3温度对菌丝体生长的影响前期研究结果显示，PG46和PG79菌丝生长的适宜温度范围均为20～30℃，在该范围内进一步筛选各菌株的最适生长温度。结果显示（图3），随着温度的升高，2株菌的生长速度均呈先上升后下降的趋势。其中，PG46在25℃和28℃时，菌丝生长速度快且浓密，分别为0.50cm/d和0.53cm/d；PG79在28℃时，菌丝生长速度最快且浓密，为0.56cm/d；当温度高于28℃时，菌丝生长速度均开始下降，并且中温菌株PG79的生长速度下降较明显且菌丝形态发生改变，菌落形态变得不规则（图4）。综上，2株巨大侧耳菌株的菌丝最适生长温度大致相同，均为25～28℃，但菌丝体耐受温度范围不同，30℃时中温菌株PG79开始遭受高温胁迫。

2.1.4pH对菌丝体生长的影响由图5可知，PG46和PG79在pH为5～9范围内均可生长，且生长速度变化不大。当培养基偏酸性时，菌丝洁白浓密且形态规则，但生长速度较慢。随着pH升高，菌丝生长速度加快，在pH为7时生长速度最快，分别为0.55cm/d和0.54cm/d。当培养基偏碱性时，随着pH的升高，菌丝变稀疏且呈明显放射状，但整体生长速度较快。综上，2株巨大侧耳的菌丝均适宜偏中性（pH7）环境生长，但适应的酸碱度范围较广。

2.1.5正交试验由于单因素试验不能检测各因素的交互影响，因此，基于单因素试验结果，开展正交试验（表1），以进一步探究2株菌的最适生长条件。由表2和表3可知，PG46和PG79在9种组合下均可生长，且与单因素试验结果大致相同，即以麦芽糖为碳源、酵母浸粉为氮源、培养温度为28℃、培养基pH为7（组合1）时，为最适生长条件。但也存在一定差异，除组合1外，PG46在组合7（可溶性淀粉为碳源、酵母浸粉为氮源、培养温度为25℃、培养基pH为8）中，菌丝生长也可达到最佳状态；PG79在组合4（蔗糖为碳源、酵母浸粉为氮源、培养温度为30℃、培养基pH为6）和组合7中，均可达到最佳生长状态。以上结果说明，各因素间的交互作用对菌丝生长影响较大，在统计分析中不可忽略。另外，方差分析结果（表4，表5）还显示，4个因素对菌丝生长的影响程度依次为：氮源＞pH＞温度＞碳源。

2.2液体发酵条件优化

2.2.1装液量对液体发酵的影响在液体发酵过程中，250mL三角瓶中装液量直接影响菌丝体的供氧情况。由图6可知，在一定范围内，随着装液量的增加，PG46和PG79的菌丝体生物量均呈先上升后下降的趋势。在装液量为120mL时，菌丝生物量均达到最大，分别为5.58g/L和6.83g/L，且与100mL装液量无显著性差异，但菌丝球大小更均匀。综上，2株巨大侧耳液体发酵的最适装液量均为120mL。

2.2.2转速对液体发酵的影响由图7可知，随着摇床转速的增加，PG46和PG79的菌丝体生物量呈先增加后趋于平稳的趋势。当转速为150r/min时，PG46和PG79的菌丝生物量达最高，分别为0.62g和0.82g；转速继续增大，菌丝体生物量无显著变化，但菌丝球大小均一度和生长点数量有所下降。因此，综合菌丝生物量和菌丝球均一度指标，确定150r/min为2株巨大侧耳液体发酵的最适摇床转速。

2.2.3接种量对液體发酵的影响由图8可知，PG46和PG79的菌丝体生物量随着接种量的增加而增大。当接种量为12%时，菌丝生物量达到最大，分别为0.79g和0.93g；其中，PG79接种量为10%、12%、15%的菌丝体生物量无显著差异，但接种量为12%的菌丝球大小更均匀；PG46接种量为12%、15%的菌丝体生物量无显著差异。因此，最终确定2株巨大侧耳菌株的最适接种量为12%。

2.2.4菌丝生长动态变化由图9可知，PG46和PG79的菌丝体生长均呈“对数增长”模式，且PG79的菌丝生物量始终高于PG46，与平板上的生长速度差异相符（PG79>PG46）。PG46在发酵3～9d时生长速度最快，第9天后生长变缓，第15天菌丝生物量最高（0.95g），之后趋于稳定；PG79在发酵3～7天时生长速度最快，第7天后生长变缓，第13天菌丝生物量最高（1.09g），之后趋于平稳。

3讨论

由于巨大侧耳的研究起步较晚，现有研究主要集中在分类地位、营养价值、活性成分、生物学特性、栽培技术等方面[3，8]，但涉及的研究报道较少并且不够深入。其中，生物学特性研究大多只针对1株菌株开展，由于菌株间的遗传多样性，导致试验结果的通用性较差[16-17]。本研究以2株具有代表性的不同温型巨大侧耳菌株为材料，采用单因素和正交试验相结合的方法，从碳源、氮源、温度和pH4个方面开展生物学特性研究，并对液体发酵条件进行优化，分析菌丝生长的动态变化。

在生物学特性试验中，PG46和PG79的最适碳源均为麦芽糖，麦芽糖为二糖，与多数食用菌优先利用单糖或双糖的结果一致[18]。以酵母浸粉和蛋白胨为氮源时，2株菌株菌丝浓密且长速较快，但以硫酸铵和氯化铵为氮源时，菌丝长势较差且菌落形态不规则，说明有机氮比无机氮更适宜巨大侧耳菌丝生长，可能与有机氮中提供的维生素、微量元素等营养物质相关[13，19]。PG46和PG79菌丝的最适生长温度均为25～28℃，但菌丝体耐受温度范围不同，30℃时PG46菌丝可正常生长，但PG79菌落形态变得不规则，这一现象与出菇温型相符。2株菌株均适宜偏中性（pH7）环境生长，与孟灵思等[20]的研究结果一致。在试验范围内（pH为5～9），菌丝均长势较好，说明巨大侧耳适应的酸碱度范围较广，适合进行规模化推广。正交试验论证了单因素试验结果，但也存在部分差异，进一步说明在多因素试验中正交试验的必要性[21]。

液体发酵具有周期短、成本低、产量高的特点，是目前食用菌进行规模化栽培的主要发酵方式，同时也是生理活性物质提取的重要工艺[22-23]。三角瓶中的装液量直接影响菌丝体的供氧情况。随着装液量的增加，营养物质含量增加但氧气含量不断降低[24]。本研究中，当装液量达到120mL时，菌丝生物量最大且菌丝球大小更均匀，说明此时营养物质含量和供氧水平达到平衡，过高或过低均不利于菌丝生长。同样，摇床转速也直接影响到发酵液中的溶氧水平[25]。摇床转速过低时菌球过大，当转速为150r/min时，菌丝生物量最高，且菌丝球大小均匀，但转速过高形成的菌球过小甚至无法形成完整菌球，影响下一步研究。在工业化生产中，接种量高低直接影响生产成本。当接种量为12%时，菌丝生物量最高，但与15%接种量无显著差異，考虑成本，最终确定12%为最适接种量。在液体发酵中，发酵终点也是必须考虑的重要环节。由于培养过程中，菌球处于封闭状态，营养物质的消耗、氧气的耗损、菌球生长过程中生存空间的缩小及其所产生的次级产物，均会影响菌球的生长[26]。本研究中，2株菌株的菌丝体生长呈“对数增长”模式。在发酵前7d（PG79）或前9d（PG46）时，菌丝处于对数生长期，菌丝活力旺盛，长速最快，可用于酶活性测定、原生质体制备等菌丝活力相关的研究[27-28]；在发酵至15d或13d时，菌丝生物量最高，可用于生理活性成分提取和菌袋接种等菌丝生物量相关研究[22-23]；继续发酵，菌丝生物量降低，不利于巨大侧耳的菌丝体生长。

综上，PG46和PG79菌丝体的生物学特性基本一致，最适碳源为麦芽糖，最适氮源为酵母浸粉和蛋白胨，最适pH为7，最适温度为25～28℃。在生物学特性研究的基础上，当摇床转速为150r/min，装液量为120mL，接种量为12%时，更适宜巨大侧耳菌丝体的液体发酵，且PG46和PG79的菌丝体生物量均呈“对数增长”的模式。研究结果可为不同温型巨大侧耳的规模化栽培奠定基础，以进一步推动热区食用菌产业的发展。