邻苯二甲酸对橡胶树RRIM600种子萌发和幼苗生长的影响

王纪坤 安锋 周立军 彭文涛 程琳琳 谢贵水

关键词：邻苯二甲酸；橡胶树；种子萌发；生长

橡胶树（HeveabrasiliensisMuell.Arg.）是我国热区最大的经济树种，其割胶产生的天然橡胶在通用性能和抗撕裂性能方面显著优于合成橡胶，是重要的工业原料和战略资源[1]。我国从20世纪50年代开始种植橡胶树，目前种植面积约为113.3万hm2、年产天然橡胶约80万t[2]，但由于橡胶树多年连作与多代种植，胶园已出现土壤酸化严重、地力衰减、根病面积扩大[3-5]、单位面积产量下降等连作问题，影响了天然橡胶产业的可持续发展，威胁到我国天然橡胶生产的战略安全。

化感作用是指植物通过适当的途径向环境释放特定的化学物质，从而直接或间接影响邻近或后续同种或是不同种植物萌发和生长的效应[6]，如果化感物质的供体和受体是同一种植物，且对该植物的生长发育产生不利影响，则这种现象被称为自毒作用，是化感作用的一种特殊形式[7-8]。自毒作用是植物连作障碍形成的主要原因之一。有研究指出，酚酸类化合物是目前公认的自毒物质，会对植物细胞膜的通透性、酶的含量与活性、矿物质元素的吸收与利用、蛋白质和核酸的代谢、光合作用等生理活动产生负面影响[8]。

邻苯二甲酸是酚酸类物质中最具代表性的化感物质，也是橡胶树根系分泌物的含量较高的物质之一[9-10]。已有研究显示邻苯二甲酸能够抑制莴苣和小豆根生长[11-12]，而对萝卜、辣椒种子萌发及幼苗生长的影响表现为“低促高抑”[13-14]；还能导致燕麦、玉米以及百合幼苗膜脂过氧化，抑制幼苗生物量增加[15-17]。目前其对橡胶树种子萌发和幼苗生长等方面影响的研究未见报道。因此，为明确邻苯二甲酸对橡胶树是否存在自毒作用，本研究以橡胶树RRIM600种子和幼苗为试验材料，采用外源邻苯二甲酸模拟研究其对橡胶树种子萌发、幼苗生长和生理指标的影响，探索橡胶树自毒作用效应，以期为客观评价邻苯二甲酸对橡胶树自毒作用危害提供基础数据支撑，进而为橡胶树连作障碍机制提供化感方面的理论依据。

1材料与方法

1.1材料

供试橡胶树品种为RRIM600，种子采自中国热带农业科学院橡胶研究所种质圃；邻苯二甲酸为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2方法

1.2.1种子发芽与幼苗生长试验试验于2021年8—9月在中国热带农业科学院橡胶研究所实验室内进行，选取健康种子30粒，使用高锰酸钾进行消毒，然后放在铺有3层滤纸的培养皿中，加入不同浓度的邻苯二甲酸溶液（分别为0.05、0.50、1.00、2.00mmol/L），以加蒸馏水为对照，每个处理3次重复，然后将培养皿放置在温度25℃、湿度70%的人工气候箱中浸种培养，光周期为13h光照/11h暗室，每天补充相应浸提液，保持滤纸湿润，连续浸种20d，每天9：00记录种子萌发数量。

经上述处理后得到的橡胶苗，再继续培养10d后，测定芽长、根长、苗鲜重、根鲜重等指标，每个处理3次重复，每个重复选5株，并取样品叶片在室内测定其他生理指标。

1.2.2生理指标测定叶绿素（Chl）和类胡萝卜素含量参考高俊凤[18]的方法进行测定。丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定；脯氨酸（proline，Pro）含量使用酸性茚三酮比色法测定；超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活性采用氮蓝四唑法测定；过氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈创木酚法测定；过氧化氢酶（catalase，CAT）活性采用紫外吸收法测定[19]。

1.3数据处理

种子发芽率、发芽势、发芽指数采用以下公式计算：

种子发芽率=发芽种子数/供试种子数×100%发芽势=发芽高峰期种子数/供试种子数×100%

发芽指数（GI）=Σ（Gt/Dt）式中，Gt为发芽第ｔ天时的发芽数，Dt为相应的发芽天数[20]。

采用Excel2016软件进行数据整理，通过SPSS25软件进行单因素方差分析和Duncans多重样本差异显著性分析（P<0.05），利用Origin2016软件作图。

2结果与分析

2.1鄰苯二甲酸对橡胶树种子萌发的影响

从图1可以看出，邻苯二甲酸均延缓了种子初始萌发时间，降低了种子发芽率。不同处理的橡胶树种子初始发芽时间不同，对照种子在浸种后7d开始发芽，而邻苯二甲酸处理的种子在浸种后9d才开始发芽；随着浸种时间的增加，各处理的橡胶树种子的发芽率逐渐增加，在浸种的20d后发芽率达到最高；整个发芽试验期间，对照种子发芽率始终高于所有邻苯二甲酸浸种处理。说明所有浓度邻苯二甲酸对橡胶树种子萌发均存在抑制作用。

由表1可以看出，橡胶树种子发芽率、发芽势、发芽指数和发芽速率均随邻苯二甲酸浓度升高呈现下降趋势，且各指标均显著低于对照，表明0.05～2.00mmol/L邻苯二甲酸显著抑制橡胶树种子萌发；不同浓度邻苯二甲酸处理的种子发芽率比对照分别下降了6.94%、19.40%、19.40%、23.60%，发芽势比对照分别下降了32.61%、28.26%、50.00%、58.69%，发芽指数比对照分别下降了23.46%、28.13%、37.67%、42.75%，发芽速率比对照分别下降了17.20%、24.33%、31.39%、37.18%。由此可见，不同浓度邻苯二甲酸均对橡胶树种子发芽率、萌发速率和萌发的整齐度产生抑制作用，且浓度越高抑制作用越强。

2.2邻苯二甲酸对橡胶树生长的影响

由表2可以看出，0.05～2.00mmol/L的邻苯二甲酸处理均不同程度抑制芽长、芽基径、根粗的生长，并减少了幼苗生物量的积累，所有生长指标在邻苯二甲酸达到2.00mmol/L降至最低。与对照相比芽长下降12.91%～40.70%、芽基径下降20.05%～21.59%、根粗下降7.89%～34.13%、芽重下降16.18%～26.47%、根重下降20.00%～36.00%，但不同浓度邻苯二甲酸处理间的芽基径、芽重和根重等指标差异不显著。与对照相比，0.05mmol/L的邻苯二甲酸处理促进了根的伸长，当邻苯二甲酸浓度达到1.00mmol/L时，开始抑制根的伸长，且浓度越高抑制作用越强。所有生长指标在2.00mmol/L时达到最低。上述结果表明，邻苯二甲酸抑制橡胶树幼苗芽的伸长和生物量积累，降低了芽基径和根粗的生长，而对根长生长的影响表现为“低促高抑”，且2.00mmol/L邻苯二甲酸对幼苗生长抑制作用最大。

2.3邻苯二甲酸对橡胶树幼苗色素含量的影响

如图2所示，除叶绿素a外，橡胶树叶片其他色素含量随邻苯二甲酸处理浓度的增加表现为先增加后减少的趋势。0.05mmol/L的邻苯二甲酸处理幼苗叶绿素a显著下降，比对照降低21.18%，叶绿素b显著升高，并达到峰值，比对照增加58.01%，叶绿素总量和类胡萝卜素含量无显著变化；当邻苯二甲酸浓度达到0.50mmol/L时，叶绿素a、叶绿素总量与类胡萝卜素含量达到峰值，与对照相比，叶绿素a增加37.78%，叶绿素总量增加33.92%、类胡萝卜素增加29.06%；当浓度达到1.00mmol/L时，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量与类胡萝卜素含量均下降，至2.00mmol/L时所有色素含量降至最低。这些结果说明，0.05mmol/L与0.50mmol/L邻苯二甲酸诱导叶绿素和类胡萝卜素含量的增加，进行补偿生长，提高光能利用效率；1.00mmol/L和2.00mmol/L邻苯二甲酸处理导致色素结构被破坏，色素含量下降，抑制幼苗光合作用。

2.4邻苯二甲酸对橡胶树丙二醛和渗透调节物质含量的影响

由图3可见，邻苯二甲酸对橡胶树幼苗丙二醛和渗透调节物质含量变化均随处理浓度增加基本上呈现逐渐增加的趋势。不同浓度邻苯二甲酸处理的橡胶树MDA含量均显著高于对照，2.0mmol/L邻苯二甲酸处理的MDA含量最高，比对照高50.95%。说明邻苯二甲酸使幼苗细胞中发生膜脂过氧化作用，且随处理浓度增加膜脂过氧化程度逐渐增加。

由图3可见，不同浓度邻苯二甲酸处理均显著促进橡胶树游离脯氨酸含量的增加，2.00mmol/L邻苯二甲酸处理的游离脯氨酸含量最高，比对照高71.91%。0.05mmol/L邻苯二甲酸处理的可溶性糖与对照差异不显著，当邻苯二甲酸浓度超过0.50mmol/L时，可溶性糖均不同程度增加（P<0.05），2.0mmol/L邻苯二甲酸处理的可溶性糖含量最高，比对照高35.32%。这说明游离脯氨酸在0.05mmol/L邻苯二甲酸胁迫处理时产生响应，当浓度达到0.50moml/L后，游离脯氨酸和可溶性糖共同产生响应，且游离脯氨酸响应邻苯二甲酸胁迫的启动浓度低于可溶性糖。

2.5邻苯二甲酸对橡胶树幼苗酶活性的影响

由图4可见，橡胶树SOD、POD活性随邻苯二甲酸处理浓度增加而逐渐减少，1.00mmol/L与2.00mmol/L邻苯二甲酸处理橡胶树SOD活性显著低于对照（P<0.05），0.50、1.00、2.00mmol/L邻苯二甲酸处理橡胶树POD活性显著低于对照；CAT活性随邻苯二甲酸处理浓度增加而先增加后减少，0.05、0.50mmol/L邻苯二甲酸处理橡胶树CAT活性均显著高于对照，CAT活性峰值均为0.05mmol/L，其活性比对照高80.15%；当邻苯二甲酸浓度达到2.00mmol/L时，所有酶活性均降至最低。上述结果表明，在低浓度邻苯二甲酸胁迫过程中，SOD、POD活性受到抑制，CAT活性未完全受到抑制，CAT在抵御邻苯二甲酸胁迫作用明显；但高浓度邻苯二甲酸抑制所有酶活性，且2.00mmol/L对所有酶活性影响最大。

3讨论

植物的自毒作用一般会对同种或同类植物的生长发育和器官建成具有抑制作用。种子萌发和植株生长对外界环境胁迫较为敏感，常被作为鉴定植物自毒作用的生物指标。邻苯二甲酸是橡胶树根系分泌的主要次生代谢产物之一，已被证明是一种典型的酚酸类自毒物质。本研究结果表明，0.05～2.00mmol/L邻苯二甲酸胁迫的橡胶树种子发芽率和幼苗植株鲜重显著减少，说明邻苯二甲酸对橡胶树种子萌发和幼苗生长存在抑制作用。这与前人观察到邻苯二甲酸对小豆、玉米、马铃薯[21-23]等作物种子萌发和幼苗生长的抑制作用的研究结果一致。种子在萌发过程中内部发生复杂的物质代谢和酶促反应。邻苯二甲酸抑制橡胶树种子萌发机制可能是影响种子内部的物质代谢及代谢关键酶的活性，使种子发生劣变、活力下降，进而导致种子初始萌发时间延后，发芽率下降的关键因素。该机制在苏文桢等[13]发现的邻苯二甲酸能够抑制辣椒种子活力，降低其发芽率中得到印证。

叶绿素是光合作用的主要色素，其含量水平是植物受到胁迫的特征指标之一。类胡萝卜素是辅助色素，被认为是低分子量的抗氧化剂，具有淬灭活性氧的作用，保证叶绿体正常的光电子传递。非生物胁迫环境下，植株中叶绿素含量减少，光合膜透性急剧增加，光合膜受损加剧，由于膜的损伤促使叶绿素分子从叶绿素复合蛋白中暴露，更容易与O2接触，促使活性氧生成，加剧光合色素的降解和光合机构的损伤，使植株光合能力下降[24]。本研究中，低浓度邻苯二甲酸诱导幼苗提高叶片叶绿素含量和类胡萝卜素，随着邻苯二甲酸浓度增加，胁迫加剧，叶绿素含量和类胡萝卜素逐渐降低，并呈现不可逆的趋势。说明橡胶树在低浓度邻苯二甲酸胁迫时，通过积累幼苗叶绿素含量，提高光能利用效率，进行补偿生长，同时提高类胡萝卜素含量来淬灭过多的活性氧，避免对叶绿体膜结构的伤害，维持叶片的光合作用；但随着邻苯二甲酸浓度升高，橡胶树自身调节机制减弱，保护系统失调，导致叶绿素和类胡萝卜素酶合成缓慢或快速分解，光合作用下降。这与邻苯二甲酸对辣椒叶片叶绿素含量影响的结果相似[13]。

MDA是細胞中发生膜脂过氧化的最终分解产物，其含量水平可作为逆境条件下细胞内发生膜脂过氧化损伤的指标[25]。邻苯二甲酸胁迫下，橡胶树幼苗MDA含量显著增加，表明膜质过氧化伤害加剧，这与BAI等[26]在海棠幼苗结果一致，说明邻苯二甲酸对光合膜和细胞膜结构形成伤害。此外，前人研究显示MDA含量的增加与非生物胁迫后O2?和H2O2含量的增加有关[27]，邻苯二甲酸胁迫导致MDA的增加可能触发橡胶树产生活性氧自由基（ROS）并诱导氧化应激，破坏细胞膜结构，导致细胞完整性丧失。渗透调节是植物抵御逆境胁迫的一种适应性反应，是一种重要的耐胁迫机制。植物通过积累渗透调节物质来调节细胞内渗透势、维持平衡水势，以维持正常的细胞功能和新陈代谢[14，28]。脯氨酸与可溶性糖是植物的2种重要的渗透调节物质。本研究观察到，0.05mmol/L邻苯二甲酸胁迫时脯氨酸增加，当邻苯二甲酸达到0.50mmol/L后，脯氨酸与可溶性糖含量均显著增加，表明橡胶树通过积累游离脯氨酸与可溶性糖来调节细胞内渗透势，维持水分平衡及细胞膜的稳定性，而脯氨酸受邻苯二甲酸胁迫启动浓度低于可溶性糖。

正常生长条件下，细胞内氧自由基的产生和消除存在动态平衡。生物与非生物胁迫会导致活性氧的形成，活性氧增多会影响膜的通透性，损坏DNA和蛋白质，诱导膜脂过氧化，并最终导致程序性细胞死亡。SOD、CAT、POD是植物重要的抗氧化保护酶系统，通过提高抗氧化酶活性来清除过量活性氧，从而抵御逆境胁迫[29-30]。本研究观察到，0.05、0.50mmol/L邻苯二甲酸胁迫显著抑制SOD、POD活性，促进CAT活性，膜脂过氧化，幼苗体内活性未能及时得到清除，膜结构受损，MDA含量增加；当邻苯二甲酸处理浓度达到1.00mmol/L后，抗氧化酶系统被破坏，SOD、POD、CAT活性均降低，体内活性氧含量增加，膜质过氧化程度加剧。这与耿广东等[12]、郭伟等[15]在辣椒和燕麦的研究结果一致。

总之，邻苯二甲酸抑制橡胶树幼苗生长发育机制可能是邻苯二甲酸胁迫导致橡胶树产生活性氧，影响了细胞代谢活动和生理功能，使幼苗生长受到抑制；尽管幼苗在低浓度邻苯二甲酸胁迫下通过增加CAT活性来清除活性氧，并提高光合色素含量进行光合补偿生长以及增加渗透调节物质平衡渗透势，但这只能缓解邻苯二甲酸胁迫的影响，却不能够消除邻苯二甲酸引起的所有伤害；高浓度邻苯二甲酸胁迫下，幼苗色素含量降低，光合作用补偿生长消失，抗氧化酶系统遭到破坏，酶活性下降，细胞膜结构遭到破坏，活性氧急剧增加，幼苗生长进一步受到抑制。

综上所述，邻苯二甲酸积累推迟了橡胶树RRIM600种子初始萌发时间，降低种子萌发率和萌发速率，导致橡胶树幼苗物质代谢和生理功能紊乱，并抑制生长发育，具有化感自毒作用。本试验仅研究橡胶树种子萌发和幼苗生长发育的影响，关于其对橡胶树胶乳产量的影响还有待于进一步研究。