濒危植物粗茎紫金牛茎段愈伤组织再生体系的建立

周艳 李冬梅 吴坤林 宁祖林

关键词：濒危植物；粗茎紫金牛；愈伤组织；再生体系

粗茎紫金牛（ArdisiagigantifoliaStapf）为报春花科（Primulaceae）紫金牛属常绿灌木，高50～70cm，株型紧凑优美，茎粗壮不分枝，叶通常聚生于茎顶端，叶片肥大似扇子，上面深绿色，背面紫红色，花紫红色或淡粉色，花量大而密集，花期长，果熟时鲜红或紫粉色，耐荫性强，观赏价值高，可作为室内盆花或园林花境素材，极具市场开发应用前景[1]。粗茎紫金牛自然分布范围狭窄，仅分布于我国云南河口，生于海拔100～400m的沟谷常绿阔叶林下[2]，笔者在野外调查过程中仅在河口南溪镇和古林箐镇两地沟谷林下发现个体数量极少的野生居群。因粗茎紫金牛野生资源稀少，被列为《中国生物多样性红色名录-高等植物卷》极危（CR）物种[3]，具有重要的保护价值和研究意义。

迁地保护于华南植物园的粗茎紫金牛生长良好，每年开花，但难以结实，存在繁殖障碍问题。刘华等[4]已申报了粗茎紫金牛扦插、压条繁殖专利技术，但受季节和繁殖材料的限制，繁殖效率不高。李冬梅等[5]申报了利用粗茎紫金牛嫩叶为外植体的组织培养专利技术，公开了其继代增殖系数最高为4.0。孙英坤等[6]研究认为TDZ能有效促进堇叶紫金牛（A.violacea）不定芽分化。符运柳等[7]对走马胎（A.kteniophylla）离体培养及植株再生生根壮苗阶段添加了10%的CW，但未起到壮苗增高效果。迄今为止，紫金牛属植物组培快繁技术研究主要以茎段和嫩叶为外植体，研究集中在外植体的消毒方式、不同植物生长调节剂配比对腋芽诱导、增殖与生根的影响、不同基质对移栽成活率的影响[8-10]等方面。目前尚无粗茎紫金牛愈伤组织再生体系建立方面的研究。鉴于此，本研究利用粗茎紫金牛茎段为外植体进行愈伤组织再生体系的建立，探究植物生长调节剂和有机物对其组织培养的影响，以期建立高效的粗茎紫金牛离体再生体系，为该物种的保育和种苗的规模化生产提供技术支撑。

1材料与方法

1.1材料

供试材料为粗茎紫金牛（A.gigantifoliaStapf）无菌苗，保存于华南植物园濒危植物繁育中心。

1.2方法

1.2.1TDZ和NAA对茎段愈伤组织诱导的影响将粗茎紫金牛无菌苗切成长约2.0cm带1个茎节的切段，接种到培养基WPM+NAA0.10mg/L+TDZ（0.10、0.25、0.50、0.80、1.00、1.50mg/L）进行愈伤组织诱导，以不添加植物生长调节剂为对照，每个浓度梯度处理10瓶，每瓶接种2个外植体，重复3次。培养45d后观察记录各处理培养结果，并统计其愈伤组织诱导率、不定芽诱导率和茎段存活率。

愈伤组织诱导率＝产生愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%

不定芽诱导率＝产生不定芽的外植体数/接种外植体总数×100%

茎段存活率=外植体成活数/接种外植体总数×100%

1.2.2TDZ对愈伤组织增殖的影响将诱导获得的愈伤组织分切成重约0.10g的团粒，接种到培养基WPM+TDZ（0.30、0.50、0.80、1.00mg/L）进行愈伤组织的增殖培养，以不添加植物生长调节剂为对照，每个浓度梯度处理10瓶，每瓶接种2团，重复3次。培养45d后统计愈伤组织存活率和愈伤组织增殖系数。

愈伤组织存活率=成活的愈伤组织团粒数/接种愈伤组织粒总数×100%

愈伤组织增殖系数=增殖培养后愈伤组织鲜重/接种愈伤组织鲜重

1.2.36-BA和NAA对愈伤组织不定芽诱导的影响将增殖培养的愈伤组织分切成重约0.10g的团粒，接种到培养基WPM+0.20mg/LNAA+6-BA（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mg/L）进行不定芽诱导，以不添加植物生长调节剂为对照，每个浓度梯度处理10瓶，每瓶接种2团，重复3次。培养45d后统计不定芽诱导率。

不定芽诱导率＝产生不定芽的外植体数/接种外植体总数×100%

1.2.46-BA对不定芽增殖的影响将诱导出的丛生芽分切，以双芽为单位接种到培养基WPM+6-BA（2.00、4.00、6.00、8.00mg/L）上进行不定芽的增殖培养，以不添加植物生长调节剂为对照，每个处理10瓶，每瓶接种2个单位，重复3次。培养45d后统计不定芽增殖系数。

不定芽增殖系数=新增不定芽数/接种不定芽数

1.2.5NAA和CW对生根壮苗的影响将生长健壮、长势基本一致的高2～3cm不定芽接种至WPM+NAA0.20mg/L+CW（5%、10%、15%、20%、25%体积分数）的培养基中进行生根壮苗实验，以不添加CW为对照，每个浓度梯度处理10瓶，每瓶接种2个不定芽，重复3次。培养45d后统计生根率、株高、根数、根长、鲜重增量。

生根率＝生根不定芽数/接种的不定芽总数×100%

鲜重增量（g）=培养后组培苗的鲜重-初始不定芽的鲜重

1.2.6移栽基质对组培苗生长的影响当粗茎紫金牛生根瓶苗高度达4～5cm、叶片数达4片时，于遮光率为60%的温室中炼苗2～3d，接着开盖炼苗2～3d，将炼苗后的瓶苗取出，小心洗去附着于根部的琼脂，移栽到准备好的基质穴盘中，每个穴孔种植1株。以珍珠巖∶泥炭土按体积比为0∶1、1∶3、1∶6、1∶8和1∶10等5种比例混合基质作为移栽基质，采用54cm×28cm的32孔育苗筛，用稀释1000倍的多菌灵溶液浸泡2h后，滤干备用。每种比例混合基质处理20株，重复3次，期间保持湿度90%以上，遮阴度60%左右。60d后统计移栽成活率。

移栽成活率＝成活苗数/移栽总苗数×100%

1.3数据处理

所有数据均采用Excel2003软件进行统计处理，采用SPSS19.0软件进行方差分析和Duncans多重比较。

2结果与分析

2.1TDZ和NAA对茎段愈伤组织诱导的影响

从图1可看出，茎段外植体在培养基WPM中添加0.10mg/LNAA和不同浓度的TDZ可成功诱导出愈伤组织和不定芽。TDZ与0.10mg/LNAA结合使用时，不同浓度的TDZ对茎段存活、愈伤组织和不定芽诱导具有促进作用。由表1可知，在不添加任何TDZ和NAA的培养基上，茎段存活率为100.00%，但均无愈伤组织和不定芽形成。当TDZ浓度为0.10～0.50mg/L时，TDZ对茎段存活率和愈伤组织诱导的影响差异不显著，愈伤组织和不定芽的诱导率随TDZ增加而逐渐递增；TDZ在0.5mg/L时，愈伤组织诱导率最高达96.67%，且愈伤组织长势良好，呈黄绿色或浅绿色（图1C）。TDZ浓度为0.50～1.50mg/L时，茎短成活率、愈伤组织和不定芽的诱导率随TDZ浓度增加而逐渐降低，但TDZ浓度在0.50～0.80mg/L范围内，TDZ对愈伤组织和不定芽的诱导率差异不显著。当TDZ浓度为1.50mg/L时，成活率降至80.00%，愈伤组织诱导率达最低值54.17%，不定芽诱导率低至23.33%，此时愈伤组织长势差，且呈黄绿色（图1D）。

2.2TDZ对愈伤组织增殖的影响

由表2可知，以WPM培养基添加不同浓度TDZ对愈伤组织增殖具有显著影响。随着TDZ浓度增高，愈伤组织存活率呈现先上升后下降的趋势，TDZ浓度为0.50mg/L时，存活率达到最高93.33%。在不添加TDZ的培养基上，愈伤组织鲜重增殖系数为1.62，愈伤组织呈浅绿色，仅有少数芽点。当添加TDZ浓度为0.30mg/L时，其增殖系数下降为0.26，愈伤组织呈浅黄绿色颗粒状，结果表现为低浓度TDZ对愈伤组织鲜重增殖有明显的抑制作用。当TDZ浓度为0.50mg/L，增殖系数为4.42，达到最大值，愈伤组织呈浅绿或黄绿色；而TDZ浓度在0.80～1.00mg/L时增殖系数从1.26下降至0.31，愈伤组织由黄绿色、颗粒状逐渐呈现褐黄色，且多数死亡。综合分析，WPM+0.50mg/LTDZ为愈伤组织增殖的最佳培养基。

2.36-BA和NAA对愈伤组织不定芽诱导的影响

由表3可知，当NAA浓度保持在0.20mg/L时，随着6-BA浓度的增加，不定芽的诱导率呈先增加后减少的趋势；当6-BA浓度低于2.00mg/L时，每团愈伤诱导出的不定芽较少，呈黄绿色或绿色（图2C）；当6-BA浓度为2.00mg/L时，不定芽的诱导率达到最高，为100.00%，每团愈伤诱导出大量不定芽，芽体为绿色，生长状况较好（图2A，图2B）；当6-BA浓度高于2.00mg/L时，不定芽诱导率随着6-BA浓度的增加而下降；当6-BA浓度为3.00mg/L时，不定芽诱导率最低为56.67%，芽体为黄绿色至黄色（图2C）。综合考虑，WPM+2.00mg/L6-BA+0.20mg/LNAA为粗茎紫金牛愈伤组织增殖的最佳培养基。

2.46-BA对不定芽增殖的影响

由表4可知，在WPM培养基上添加不同浓度的6-BA对不定芽的增殖具有显著差异。本研究发现，单独使用6-BA对粗茎紫金牛不定芽的增殖有显著影响，随着6-BA浓度的增加，不定芽的增殖系数呈现先升高后降低的趋势，当6-BA浓度为4.00mg/L时，诱导出的不定芽生长正常，芽体为浅绿色或绿色，小叶狭窄且未展开（图2D），增值系数达到最大值为3.90；当6-BA浓度高于6.00mg/L时，增殖系数显著下降；当6-BA浓度为8.00mg/L时，增殖系数降至最低0.97。可见，WPM+4.00mg/L6-BA为对不定芽的增殖有较好的促进作用，最适浓度因植物种类不同有所差异。

2.5NAA和CW对生根壮苗的影响

将无根苗转接到WPM+0.20mg/LNAA+CW上进行生根壮苗，15d左右开始生根，生根率达100%，CW能诱导根系生长，但对株高生长有抑制作用。由表5可知，NAA浓度固定为0.20mg/L时，在不添加CW的培养基中，植株平均高度为4.25cm，在培养基中添加不同浓度CW，其平均株高均低于不添加CW的处理，当CW浓度在0～10%范围时，对株高的影响差异不显著，而当CW浓度高于10%时，随着CW浓度增加，植株平均高度降低，且达到显著性差异。

CW浓度在0～10%范围时，CW浓度对植株的根条数、根长和鲜重增量的影响均无显著差异。当CW浓度为10%时，根长和鲜重增量达到最大值，分别为4.36cm和1.48g，生长状态最佳（图3）。当CW浓度高于10%时，随着CW浓度的增加，根条数、根长和鲜重均逐渐减少，且达到显著差异。当CW浓度达到20%以上时，根部出现褐化现象（图3白色箭头所示）。

2.6移栽基质对组培苗生长的影响

由表6可知，移栽基质对粗茎紫金牛组培苗移栽成活率有明显差异。在泥炭土基质中，培养60d，成活率为82.78%，生长状态较差，植株弱小，叶片质地较薄且小；珍珠岩∶泥炭土以体积比1∶3～1∶10混合范围时，培养60d，成活率无显著差异，其中珍珠岩∶泥炭土以体积比1∶3混合时，成活率最高达96.67%，此时植株生长健壮，叶片质地较厚，有光泽且叶片较大（图4）。

3讨论

植物组织培养与快速繁殖技术是植物资源可持续开发利用的一种有效手段，可在短时间内生产大量优质种苗[11]。彭光天[12]对9种紫金牛属（Ardisia）植物进行组织培养，结果发现不同外植体诱导愈伤的能力存在差异，在MS+1.0mg/LNAA培养基诱导5种紫金牛幼苗生根的效果不太理想，其中百两金（A.crispa）、虎舌红（A.mamillata）、紫金牛（A.japonica）的茎段愈伤组织分化仅形成一些不定根，血党（A.punctata）和莲座紫金牛（A.primulifolia）未能形成根。符运柳等[7]对走马胎（A.kteniophylla）进行离体培养及植株再生，结果发现在MS（改良）+0.50mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+10%CW壮苗培养时，能够诱导不定芽伸长生长，但不能高频诱导不定芽增高。在本研究中，通过在WPM培养基上添加0.20mg/LNAA和CW对粗茎紫金牛幼苗生根诱导效果良好，生根率达100%，当添加10%CW时，不定根发达，植株生长健壮。推测低浓度的NAA可促进愈伤组织诱导生根，同时椰汁也促進了愈伤组织诱导生根和根长生长，使鲜重增加，植株生长健壮。

TDZ作为一种新型的植物生长调节剂，已有文献报道其不但具有很强的细胞分裂素活性，能诱导愈伤组织形成不定芽[13-14]，而且具有生长素的脱分化作用，能有效诱导愈伤组织形成[15]。本研究通过TDZ和NAA的组合不仅能使粗茎紫金牛茎段诱导出愈伤组织和增殖，同时产生不定芽，与前人的研究结果一致[16-17]。TDZ促进愈伤组织形成，也促进不定芽形成，这可能与TDZ能有效促进外植体直接诱导不定芽产生有关[18-19]。此外，本研究利用TDZ具有细胞分裂素与生长素的双重作用，对粗茎紫金牛愈伤组织进行增殖且效果良好，这与刘守赞等[10]研究发现TDZ对堇叶紫金牛茎段增殖作用效果显著优于6-BA和KT，且当TDZ浓度为0.50mg/L时，增殖倍率最高达3.14的研究结果类似。

6-BA是常用的细胞分裂素，促进植物细胞分裂、伸长和分化。本研究使用6-BA搭配NAA诱导愈伤组织分化不定芽，结果表明细胞分裂素与生长素比值对粗茎紫金牛愈伤组织不定芽分化具有显著影响，当6-BA/NAA=10时，不定芽分化率高达100%；比例大于10时不定芽分化率却呈下降趋势。符运柳等[7]对紫金牛属走马胎进行离体培养研究，结果也发现，2.00mg/L6-BA+0.10mg/LNAA的组合最利于愈伤组织分化不定芽，分化率为88.9%，而当6-BA浓度为3.0mg/L时，不定芽分化率明显下降，因此合适的细胞分裂素与生长素比值对于紫金牛愈伤组织分化不定芽最重要。

有机物的添加有利于兰科植物组培生根壮苗培养[20-21]，但在紫金牛的组织培养中还未见CW对其生根壮苗培养影响的报道。本研究结果发现，将2～3cm高的粗茎紫金牛无根苗接种在不添加植物生长调节剂的培养基中也能生根，但根量少且纤细；使用0.20mg/L浓度的NAA能有效促进粗茎紫金牛无根苗生根，平均根条数为3.37，根长为3.91cm，单株鲜重为1.41g；将NAA浓度固定为0.20mg/L，当添加浓度10%的CW时，会进一步促进无根苗的生长，平均根条数达3.80，根长达4.36cm，单株鲜重达1.48g，试管苗生长状况较好；但高浓度椰汁会使根部出现褐化现象，抑制根部生长，因此低浓度的CW有促进粗茎紫金牛生根壮苗作用。