嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲各虫态的致病力及侵染行为

吕朝军 赵建超 钟宝珠 张楚毓 陈拓 李文莲

关键词：嗜菌异小杆线虫；致病力；红棕象甲；形态学

红棕象甲（RhynchophorusferrugineusOliver）是我国重要的检疫性害虫，分布于海南、广东、广西、重庆、台湾、云南、西藏、香港、澳门、江西、上海、四川、贵州、浙江、福建等地[1-2]，也是世界上椰子（CocosnuciferaL.）、油棕（ElaeisguineensisJacq.）、椰枣（PhoenixdactyliferaL.）等棕榈科作物的重大害虫。该虫主要通过钻蛀植物的茎干和生长点危害，由于其为害隐蔽，在植株表现症状时多数已无法挽救。

目前生产上对于红棕象甲的防治方法包括茎干注射[2]、药剂喷雾[3]、信息素诱捕[4]等。在该虫生物防治方面已取得了一些成就[5-7]，其中昆虫病原线虫（entomopathogenicnematodes，EPNs）作为重要的生防因子之一[7]，可与其他生物形成共生关系[8]，截至2015年底，已报道95种斯氏线虫和16种异小杆线虫[9]。BARBARA等[10]研究了斯氏线虫（Steinernemacarpocapsae）对红棕象甲的致死效果，及其对红棕象甲生长发育及幼虫的免疫活性等影响，当EPNs通过肛门、气孔和口腔进入宿主后，会在宿主血腔中释放共生细菌引起细胞毒性，并引起败血症导致宿主死亡[11]；田间试验结果表明，EPNs对红棕象甲的预防效果达98%，治愈率达80%[12]。同时嗜菌异小杆线虫（Heterorhabditisbacteriophora）和昆虫病毒以1∶5混合对红棕象甲的防治效果较好[13]；嗜菌异小杆线虫与白僵菌（Beauveriabassiana）混用对于红棕象甲幼虫具有增效作用，尤其对低龄幼虫的增效作用更显著[14]。目前针对EPNs侵染红棕象甲的研究多集中在幼虫，而较少报道对其他虫态是否有致病性的研究，因此本文研究了嗜菌异小杆线虫H06（HeterorhabditisbacteriophoraH06）品系对红棕象甲各虫态的致病力，并对其侵染途径及侵染过程等进行系统观察，以期为红棕象甲生物防治策略的科学制定提供参考。

1材料与方法

1.1材料

红棕象甲和嗜菌异小杆线虫H06品系均由中国热带农业科学院椰子研究所生物防治实验室自繁自养。其中红棕象甲采用半人工饲料[15]饲养；嗜菌异小杆线虫H06品系以大蜡螟幼虫为寄主进行扩繁，采用Whitetrap法[16]收集3龄侵染期线虫（infectivejuveniles，IJs），用蒸馏水稀释成系列浓度，备用。

试虫繁育及实验均在温度（26±1）℃，相对湿度70%±5%的昆虫繁育室开展。

1.2方法

1.2.1嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲的致病力测定养虫杯（直径4cm，高3cm）杯底覆盖滤纸，杯顶置通气孔，用移液枪滴加1mL不同浓度线虫液至滤纸上，将红棕象甲5个龄期段（1～2龄、3～4龄、5～6龄、7～8龄、9～10龄）幼虫、卵、蛹、成虫分别置于养虫杯中。处理5d后统计试虫死亡率，并以对照组死亡率对处理死亡率进行校正。每处理30头，重复3次，以蒸馏水处理为对照。幼虫、蛹、成虫死亡标准：以昆虫针轻触虫体，完全不动者为死亡。卵死亡标准：以变红色或黑色为死亡。

死亡率=死亡虫口数/处理总虫口数×100%

校正死亡率=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）×100%

1.2.2红棕象甲不同虫态被嗜菌异小杆线虫H06品系侵染后的形态学变化使用线虫液（500IJs/mL）分别对红棕象甲6龄幼虫、预蛹、初产1d卵、新羽化成虫进行处理。其中幼虫和预蛹滴加200μL于前胸背板处，成虫滴加200μL于前胸背板和中胸之间连接处，卵直接在线虫液中浸渍5s取出，处理后将试虫单独放置于养虫盒中，成虫和幼虫以甘蔗块为补充营养。处理72h后用索尼摄像机（FDR-AX700）拍照记录红棕象甲各虫态被EPNs侵染后的典型形态学变化。

1.2.3嗜菌异小杆线虫H06品系从红棕象甲幼虫不同部位的侵入效果选取红棕象甲3龄、6龄、8龄幼虫，以每克虫体重接种100IJs剂量嗜菌异小杆线虫H06品系，分别接种于红棕象甲口器、气孔和肛门周围，处理4d后统计死亡虫数。死亡标准为用昆虫针轻触虫体，完全不动者为死亡。每处理接种30头，重复3次，以未接种处理为对照。

1.2.4嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲幼虫腹侧气孔的侵入行为观测以红棕象甲8龄幼虫为寄主，接种24h后观察虫体气孔周围嗜菌异小杆线虫H06品系的分布情况。为便于观察，用防水蓝色记号笔在红棕象甲幼虫气孔处进行轻微涂抹，利用解剖镜（凤凰XTL-165-LD500u）持续观察线虫从红棕象甲气孔侵入虫体的过程并记录。

1.3数据处理

致病力测定结果中，根据黄剑等[17]的方法，采用Excel统计软件求毒力回归方程及LC50、LC50的95%置信区间等。嗜菌异小杆线虫H06品系致病力数据采用试虫的校正死亡率进行分析，采用邓肯氏新复极差检验法（DMRT法）进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲不同虫态的致病力

红棕象甲各虫态均可被嗜菌異小杆线虫H06品系侵染（表1）。从毒力测定结果可知，嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲卵和1～2龄幼虫的毒力水平最高，二者无显著差异。随着幼虫龄期增加，红棕象甲对嗜菌异小杆线虫H06品系的敏感性逐渐降低，其LC50值逐渐增大；嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲蛹和成虫的致病力无差异，但均低于卵和1～6龄幼虫。此外，5～6龄幼虫与7～8龄幼虫之间、7～10龄幼虫与蛹之间、9～10龄幼虫与成虫之间对嗜菌异小杆线虫H06品系的敏感性均无显著差异。

2.2红棕象甲不同虫态被嗜菌异小杆线虫H06品系侵染后的形态学变化

经嗜菌异小杆线虫H06品系侵染后，红棕象甲幼虫、预蛹、蛹和卵均死亡，轻触虫体无自主反应，体色变成红色或红褐色，同时伴随虫体体壁皱缩僵硬。成虫经嗜菌异小杆线虫H06品系处理后体色加深，体表斑纹逐渐消失（图1）。

2.3嗜菌异小杆线虫H06品系对不同龄期红棕象甲幼虫不同部位的侵入效果

红棕象甲幼虫不同部位被嗜菌异小杆线虫H06品系侵染后，红棕象甲死亡率如表2所示。红棕象甲3龄幼虫的接种处理中，以气孔和肛门处接种的致死率较高，且二者无显著差异，分别为91.11%和78.89%，均显著高于口器接种处理；而在6龄幼虫和8龄幼虫的接种处理中均以口器接种致死率最高，分别为95.56%和98.89%，其次为肛门接种和气孔接种。

口器接种处理中，6龄和8龄红棕象甲幼虫死亡率无显著差异，但均显著高于3龄幼虫死亡率；在气孔接种处理中，3龄幼虫的死亡率显著高于6龄和8龄幼虫；而在尾部肛门接种处理中，供试3个龄期的红棕象甲幼虫死亡率无显著差异。

2.4嗜菌异小杆线虫H06品系从红棕象甲幼虫气孔侵入的行为观测

研究结果表明，嗜菌异小杆线虫H06品系接近红棕象甲气孔后，在气孔周围停留一段时间，之后从气孔进入虫体（图2），从开始进入气孔至完全进入虫体整个过程持续2～5min；部分线虫在进入气孔的过程中会退出，亦有部分线虫直接从气孔上爬过而不侵入虫体，接触到红棕象甲虫体气孔的线虫且成功进入虫体的比例为33.33%。

3讨论

EPNs作为一种生防因子，已经在部分害虫的防治上得到了应用。如小卷蛾斯氏线虫（Steinernemacarpocapsae）All品系与草地贪夜蛾数量比为剂，可长期较好地抑制小地老虎对烟草幼苗的危害[19]；600IJs/mL线虫液处理24h后，Wn01线虫对红脉穗螟的校正死亡率达到86.67%[20]。SHAHINA等[21]研究发现，供试的7种EPNs对红棕象甲各虫态均具有较好的致病效果；在阿联酋椰枣园红棕象甲的防控实验结果显示，一种本土分离的Heterorhabditisindicus线虫能在短时间内灭杀红棕象甲幼虫、成虫和蛹[22]。由于EPNs对昆虫宿主的高致病性[23]，小卷蛾斯氏线虫（SteinernemacarpocapsaeWeiser）和嗜菌异小杆线虫（H.bacteriophoraPoinar）[24]已制作成生防制剂并用于有害生物综合治理（IPM）中。前期研究显示，嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲幼虫具有一定的致死作用，且虫体呈现出僵硬皱缩、体色变褐、身体肿胀直至虫体腐烂、线虫游离而出的现象[7]。本研究进一步证明，嗜菌异小杆线虫H06品系不仅可侵染红棕象甲幼虫，同时对红棕象甲蛹、成虫、卵等也具有侵染活性。其中对红棕象甲卵和1～2龄幼虫的毒力水平最高，这可能与不同虫态对EPNs的耐受力差异有关，也说明在红棕象甲卵期和低龄幼虫期利用嗜菌异小杆线虫H06品系进行可取得较好的防效。

EPNs侵染寄主的方式分为3种：潜伏型、攻击型和中间型[25]。其中斯氏线虫的垂直扩散能力较强，搜索策略为潜伏型，而异小杆线虫对寄主的感应强烈且主动搜索力较强，适于侵染隐蔽性害虫[26-27]。本研究发现，嗜菌异小杆线虫H06品系在有水为介质的情况下会游离至红棕象甲幼虫气孔附近，并通过气孔进入虫体，但观察发现其进入虫体气孔无目的性，即并不是所有抵达气孔的线虫均会侵入至虫体，因此嗜菌异小杆线虫H06品系从红棕象甲气孔侵入虫体，是由气孔散发的气味吸引其向气孔定向移动？还是偶然经过气孔附近进而侵入？还需进一步深入研究。

EPNs侵入虫体后会释放共生细菌，通过细菌毒素和线虫消耗寄主营养致寄主死亡[28]，虫尸棕色表示该虫是由斯氏线虫侵染所致，而红色则为异小杆线虫侵染所致，颜色差异是由于尸体中共生细菌释放的色素不同[10]，本研究结果也表明，经嗜菌异小杆线虫H06品系侵染后，红棕象甲的卵、幼虫、预蛹、蛹及成虫等各虫态体色均变成红色或红褐色，此结果与王国汉等[28]发现的异小杆线虫侵染虫体后导致寄主尸體初为桔红色、后期为红褐色一致。

EPNs从红棕象甲幼虫不同部位接种后，死亡率存在显著差异，其中3龄幼虫处理中，以气孔和肛门处接种的致死率较高，而6龄和8龄幼虫处理均以口器接种致死率最高。在气孔接种处理中，3龄幼虫的死亡率较高；而在尾部肛门接种处理中，供试3个龄期的红棕象甲幼虫死亡率无显著差异，究其原因可能与红棕象甲幼虫的气孔、口器及肛门的发育特征有关，其致病机理还需进一步深入研究。