猪圆环病毒2型灭活疫苗佐剂选择

赵本进 何锡忠 林鸷 缪德年 彭丽英

摘  要：用水包油佐剂Merckinade SDA 25、HS1010和双向佐剂Montanide ISA 206三种不同佐剂分别制成猪圆环病毒2型灭活疫苗，对三种疫苗的稳定性、黏度、免疫仔猪后的安全性及效力进行了比较。试验结果表明，以3 000 r/min离心15 min，三种疫苗均无水析出；三种疫苗的黏度均低于200 cP；三种疫苗按2.0 mL/头的剂量接种21日龄健康易感猪，试验猪体温、采食、饮水、精神状况均正常，均无不良临床反应，剖检后各脏器均无病理变化；加强免疫后21 d，各组试验猪采血，检测猪圆环病毒2型抗体效价，结果表明，佐剂Montanide ISA 206相较Merckinade SDA 25可诱导更高水平抗体效价。攻毒试验结果表明免疫组可以得到100％的保护。根据以上试验结果，确定猪圆环病毒2型灭活疫苗使用Montanide ISA 206。

关键词：猪圆环病毒2型；灭活疫苗；佐剂；免疫效果

中图分类号：S858.28 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2023）04-0056-06

猪圆环病毒引起仔猪低效生产率，是近年来严重影响我国养猪业的传染病之一。该传染病主要侵害6～8周龄的仔猪，引起仔猪淋巴系统疾病[1]、渐进性体重下降，造成仔猪免疫机能下降、生产性能降低[2]。目前，大部分猪场通过接种疫苗预防和控制猪圆环病毒，现将我们制备的三种猪圆环病毒2型灭活疫苗的安全性和免疫效力进行评估。

1  材料

1.1 病毒

PCV/SN07-12（微生物保存登记号：CCTCC No：V201304）病毒由上海市农业科学院畜牧兽医研究所保存。

1.2 细胞

PK-15细胞（无PCV1污染）由国外引进，并由上海市农业科学院畜牧兽医研究所传代保存。

1.3 试验动物

21日龄的健康易感猪（猪圆环病毒2型PCR方法检测PCV2核酸为阴性，猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒检测PCV2抗体为阴性），购自江苏省镇江某猪场。

1.4 主要试剂

水包油佐剂Merckinade SDA 25和双向佐剂Montanide ISA 206购自赛德奥生物科技（北京）有限公司；HS1010佐剂购自杭州洪晟生物技术有限公司；猪圆环病毒 2-dCap ELISA 抗体检测试剂盒购自广州锐捷生物科技有限公司。

2  方法

2.1 半成品的制备

2.1.1 病毒液的制备

PCV2毒种接种于单层PK-15细胞，置37 ℃培养箱中吸附30 min，加入含2％的新生牛血清的DMEM培养液，37 ℃培养箱中继续培养72 h。收集细胞，－70 ℃反复冻融3次，低温离心，细胞上清液冻存备用。

2.1.2 抗原灭活

病毒液中加入万分之二的二乙烯亚胺进行灭活。

2.1.3 半成品检测

灭活前病毒液中的病毒含量均应大于等于107.0 TCID50/mL；灭活检验应无细胞病变，盲传3代免疫荧光检测结果应为阴性。灭活前后的无菌检验应均为无菌。

2.2 疫苗制备

2.2.1 水包油佐剂Merckinade SDA 25疫苗的制备

将半成品与Merckinade SDA 25以3∶1（质量比）的比例准备，置于磁力搅拌器的烧杯中，300 r/min搅拌，缓缓加入Merckinade SDA 25，在15～35 ℃乳化  10 min。分装，2～8 ℃保存备用。

2.2.2 水包油油包水双向油佐剂Montanide ISA  206疫苗的制备

取半成品和Montanide ISA 206分别加热至（30±2）℃，将Montanide ISA 206倒入烧杯中，30 ℃，200 r/min搅拌并逐渐将半成品与Montanide ISA 206以1∶1（质量比）的比例缓慢加入。待灭活抗原全部加入后，搅拌速度提高至2 000 r/min，30 ℃持續搅拌10 min。将容器逐渐降温，降温过程中持续搅拌，降温至15 ℃，停止搅拌，将乳液在15 ℃以下静置24 h。分装，2～8 ℃保存 备用。

2.2.3 水包油佐剂HS1010佐剂疫苗的制备

将半成品与HS1010佐剂以5∶1（质量比）的比例混合后在25～30 ℃充分摇匀，即制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。分装，2～8 ℃保存备用。

2.3 稳定性检验

取制备的三种疫苗各10 mL于离心管中，以3 000 r/min离心15 min。

2.4 黏度检验

将三种疫苗均按2020版《中国兽药典》[3]附录进行检验。

2.5 无菌检验

将三种疫苗均按2020版《中国兽药典》[3]附录进行检验。

2.6 安全性试验

2.6.1 分组

将20头21日龄PCV2阴性（核酸和抗体检测均阴性）健康仔猪，随机分入SDA 25佐剂疫苗组、ISA 206佐剂疫苗组、HS1010佐剂疫苗组和空白对照组，每组5头。试验猪分别接种用佐剂Merckinade SDA 25 、Montanide ISA 206或HS1010制成的猪圆环病毒2型灭活疫苗或安慰剂，均按组单独隔离饲养。

2.6.2 接种

三种疫苗分别颈部肌内注射接种一组试验猪，2.0 mL/头，对照组以相同剂量和方法注射生理盐水。

2.6.3 体温测定

免疫前3日和免疫后14日内，每天测定各组猪的体温。

2.6.4 临床观察

观察14日内各组猪的采食、饮水、精神是否正常，有无不良临床反应，疫苗的吸收情况及注射部位是否有异常反应。

2.6.5 剖检

免疫后14日，剖杀所有试验猪，观察各脏器是否有病理变化。

2.7 效力试验

2.7.1 分组

将25头21日龄（PCV2核酸和抗体检测均阴性）健康易感猪，随机分为5组，每组5头，第1～3组为免疫组，试验猪分别接种3种猪圆环病毒2型灭活苗中的1种；第4组为攻毒对照组，试验猪接种安慰剂；第5组为空白对照组，试验猪不接种猪圆环病毒2型灭活苗，也不用猪圆环病毒2型攻毒。各组分离隔离饲养。

2.7.2 免疫组

5头猪各颈部肌内注射疫苗1.0 mL/头，一免后14 d用相同剂量加强免疫一次。二免后18 d分别在每头猪的两侧腋下和两侧臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA、0.5 mg/mL），每个部位分别注射1.0 mL，每头合计4.0 mL，同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10 mL/头。

2.7.3  抗体测定

参照何锡忠等[4]推荐的方法进行抗体测定。

2.7.4 免疫攻毒

参照何锡忠等[4]推荐的方法进行免疫攻毒。

3  结果

3.1 半成品检测

灭活前测定病毒液中的病毒含量为   107.5 TCID50/mL；抗原灭活检验发现无细胞病变，盲传3代免疫荧光检测未出现荧光，为PCV2阴性。

3.2 物理性状检测

3.2.1稳定性检验

三种疫苗经离心后均无水相析出。

3.2.2 黏度检验

三种疫苗黏度均小于200 cP，详见表1。

3.3 无菌试验

三种疫苗灭活前后均无菌。

3.4 安全性试验

3.4.1 体温测定

将三种疫苗分别以2.0 mL/头的剂量免疫接种试验猪，免疫后14 d内每天测定各组试验猪的体温。结果表明，三种疫苗免疫组猪及对照组猪的体温均正常，详见表2。

3.4.2 临床观察

三种疫苗免疫猪后14 d，免疫组猪的采食、饮水、精神状况均正常，均无不良临床反应，且疫苗吸收良好，注射部位均无红肿、硬块等局部异常反应，与空白对照组猪的无明显差异，详见表3。

3.4.3 剖检

将三种疫苗分别以2.0 mL/头的剂量免疫猪。猪接种疫苗后14 d撲杀，观察各脏器的病理变化。结果表明，3个佐剂疫苗组及对照组猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴器官均无病理变化，详见表4。

3.5 效力检验

加强免疫后21 d测定各组试验猪PCV2抗体效价。结果表明，ISA 206和HS1010佐剂疫苗组抗体效价均不低于1∶3 200；SDA 25佐剂疫苗组抗体效价较低，介于 1∶800～1∶3 200；对照组抗体效价不高于1∶400，详见表5。

4  结论

猪圆环病毒病的三种疫苗接种仔猪后，仔猪的采食、饮水、体温均正常，无精神沉郁等，疫苗注射部位均无局部异常。三种疫苗对仔猪两次免疫后攻毒，免疫猪都得到保护，说明本项目组配制的猪圆环病毒2型灭活疫苗具有良好的免疫效果。该结果与潘杰等[5]的研究结果相一致。对仔猪圆环病毒2型抗体检测发现，三种疫苗对猪进行两次免疫后，免疫猪的抗体水平均高于空白对照组猪的，其中Merckinade SDA 25佐剂疫苗产生的抗体水平低于Montanide ISA 206和HS1010佐剂疫苗产生的。考虑到佐剂产品的成熟度最终选用Montanide ISA 206佐剂。

参考文献

[1] 朱子健，唐志芬，杨金雨，等．猪瘟兔化弱毒疫苗与猪圆环病毒2型灭活疫苗同时接种的免疫效果评价[J]．中国预防兽医学报， 2017，39（2）：148-151.

[2] 窦鹏勋，葛建强，张勇，等．3种疫苗单独和联合免疫对猪抗体水平的影响[J]．安徽农业科学，2009，37（31）：15259-15261.

[3] 中国兽药典委员会．中华人民共和国兽药典（2020版）[S]．北京：中国农业出版社，2021．

[4] 何锡忠，赵本进，林鸷，等．猪圆环病毒2型灭活疫苗安全性及免疫效力的评价[J]．国外畜牧学（猪与禽），2022，42（2）：30-34.

[5] 潘杰，范娟，刘俊斌，等．猪圆环病毒2型灭活疫苗（YZ株）的制备及对仔猪免疫效力的评价[J]．畜牧与兽医，2017，49（7）：94-98．