不同类型的免疫佐剂在口蹄疫疫苗中的应用研究

陈苗苗 董金杰 杜 平 王超英 （中农威特生物科技股份有限公司 甘肃 兰州 730046）

口蹄疫(Foot-and-mouth disease， FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus， FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触传染性和快速远距离传播的疫病，目前对患病牲畜尚无有效的治疗方法，只有使用口蹄疫疫苗接种动物进行积极预防[1]。常规灭活疫苗仍然是当前FMD免疫控制采用的主要疫苗，又以法国SEPPIC公司的ISA206双相油佐剂疫苗为市场主导疫苗，随着疫苗技术的发展，新型佐剂成为现在研究的热点，尤其以纳米佐剂和凝胶佐剂为主，该新型载体稳定、安全、靶向、缓释等优点克服了普通疫苗的缺点[2，3]，本研究通过三组新型疫苗载体配制的疫苗，以常规206佐剂乳化配制的疫苗作对照，较全面比较评价四组佐剂配制的疫苗物理性状和小鼠体液免疫应答水平，为以后的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗原与佐剂 （1）抗原：口蹄疫O型灭活抗原(本公司生产部提供)。（2）佐剂：IMS1313纳米佐剂(SIPPIC公司提供)、M12纳米乳佐剂(本部门研制)、HA凝胶佐剂(佳木斯大学材料学院提供)、ISA206油佐剂(SEPPIC公司提供)。

1.1.2 仪器与试剂 磁力搅拌器(德国IKA)、激光粒度分析仪(美国贝克曼)、台式高速微量离心机(赛默飞世尔)、酶标仪(购自博乐公司)、口蹄疫血清抗体检测ELISA试剂盒(购自中国农业科学院兰州兽医研究所)。

1.2 试验方法

1.2.1 乳化 IMS1313纳米佐剂、M12纳米乳佐剂、HA凝胶佐剂、ISA206油佐剂分别121℃高压灭菌30min，同一批次口蹄疫O型抗原无菌分装四份，146s为10ug/ml。IMS1313纳米佐剂、M12纳米佐剂分别在室温下与该抗原按质量比1：1预混合，磁力搅拌器1000r/min乳化5min，分装10ml链瓶中。ISA206佐剂与该抗原(30±2)℃水浴30min，按质量比1：1预混合，磁力搅拌器1000r/min乳化5min，分装10ml链瓶中。该抗原做2倍稀释后与HA凝胶佐剂按质量比6：1预混合，磁力搅拌器1000r/min乳化5min，分装10ml链瓶中。

1.2.2 性状检测 按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行性状检验。粘度检测：用1ml吸管(出口内经1.2mm)分别吸取25℃疫苗，垂直自然流出，计算0.4ml流出所需要的时间。离心检测：用10ml离心管加入10ml疫苗，以3000r/min离心30min。剂型检测：取一洁净吸管，分别吸取四组疫苗。滴于25℃无离子水表面，第一滴下部呈拖尾状或部分分散为水包油包水，若疫苗在水中迅速扩散溶于水中即为水剂。粒度检测：用1ml吸管吸取疫苗滴于粒度仪样品池中3滴，按预先设置好的参数，读取粒度值。稳定性放置试验：疫苗分别存放在4、25、37℃，放置3、7、30、90、180、365d。观察稳定性情况。

1.2.3 小鼠免疫试验 （1）血清特异性IgG检测：将灭活抗原分别与ISA206佐剂、IMS1313佐剂、HA凝胶佐剂以及M12纳米佐剂乳化的疫苗，分别免疫20g雌性BALB/C小鼠10只，免疫剂量为0.5ml[4]，分别在免疫后每隔7天断尾静脉采血，共计90d，用口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒检测血清抗体，初步测定四组佐剂乳化的疫苗对小鼠的免疫抗体水平以及消长情况。（2）数据统计：试验结果表示为平均值±标准差，数据釆用SPSS(11.5)软件进行One-way ANOVA中的LSD分析方法进行组间多重比较，以P＜0.05为差异显著，采用Microsoft Office Excel 2003软件进行绘图。

2 结果

试验结果见表1。

表1 4组佐剂配制疫苗的物理性状检测结果比较

2.1 物理性状检测

4种佐剂分别与口蹄疫O型灭活抗原乳化配制疫苗，物理性状检测结果均达到质量标准，纳米乳M12佐剂乳化的疫苗与206佐剂乳化的疫苗都是双相W/O/W疫苗，M12佐剂乳化的疫苗粒径为纳米级小于100nm，206佐剂乳化的疫苗粒径为微米级，2.13um，离心检测均未出现明显分层，粘度检测均在2～8s的容许范围，商用纳米佐剂IMS1313、羟基磷灰石HA凝胶佐剂配制的疫苗为水溶液，离心检测溶液澄清均一。

2.2 放置试验

4种佐剂乳化的疫苗放置在25℃、4～8℃以及37℃，观察疫苗分层情况，在4℃以及25℃，四组疫苗均未出现明显分层，37℃自制的M12佐剂配制的疫苗和商用IMS1313佐剂、HA凝胶佐剂配制的疫苗均未出现明显分层，ISA206佐剂乳化的疫苗出现明显分层。

2.3 对小鼠的免疫试验

4种佐剂与同批O型口蹄疫灭活抗原配制的疫苗分别免疫10只BALB/C小鼠，用液相阻断ELISA方法测定O型抗体效价，并计算Log10(效价)对照值求平均数及标准差，抗体结果如下表：

表2 4组佐剂配制的疫苗免疫90d的抗体结果

表2结果显示，4组疫苗在免疫后28d抗体水平均达到最高值，自制M12纳米佐剂疫苗组均值为2.75，IMS1313纳米佐剂疫苗组为2.56，HA凝胶疫苗组为1.51，ISA206佐剂疫苗组为2.72，90d后，M12纳米佐剂疫苗组降到2.31，IMS1313纳米佐剂疫苗组降到0.64，HA凝胶疫苗组降到0.49，ISA206佐剂疫苗组降到1.58.结果见附图。

附图 4种佐剂配制的疫苗90d内血清平均抗体效价消长情况

从附图中可以看出，自制M12佐剂配制的疫苗平均抗体均高于其他3组，能显著提高小鼠血清中FMDV特异性IgG水平(P＜0.05)。

3 讨论

（1）本试验对适用于口蹄疫生产的疫苗佐剂包括自制纳米乳佐剂M12、法国赛彼克公司的纳米佐剂IMS 1313、ISA206以及HA凝胶佐剂的乳化效果进行了评价。自制纳米乳佐剂M12为纳米级水包油包水佐剂，IMA1313为复合水溶性纳米佐剂，ISA206佐剂为常规水包油包水佐剂，HA凝胶佐剂为吸附性颗粒物佐剂，选择这四种不同类型的佐剂考察它们的乳化效果。水包油包水乳剂粘度低，并且能提高短期和长期的免疫反应。水包油包水乳剂通常诱导体液免疫反应[5]。外部水相中的抗原可立即作用于免疫系统，而内部水相的抗原就像在油包水乳剂中一样缓慢释放。而纳米佐剂疫苗粒径小、分散性好、比表面积大，易于体内吸收，能提高药物生物利用度，能显著提高细胞免疫应答[6，7]，本实验室研制的纳米乳佐剂M12具备了水包油包水佐剂和纳米佐剂的优点，能更好的适用于口蹄疫疫苗中。本试验通过剂型、粘度、离心、粒径检测以及放置试验，较全面了解了这四种不同类型的口蹄疫疫苗佐剂的物理性状及稳定性，为以后应用于口蹄疫生产提供理论依据，试验结果显示，这四种佐剂疫苗均达到质量标准。（2）四种佐剂分别与同批次O型灭活抗原乳化配制疫苗免疫BALB/C小鼠，分别在免疫后90d内每隔7d进行断尾静脉采血，其血清用液相阻断ELISA方法检测，比较IgG抗体水平差异以及消长情况。自制纳米乳佐剂M12乳化的疫苗平均抗体水平最高，且在90d内维持在2.1的较高水平，赛比克公司的IMS1313纳米佐剂以及ISA206双相油佐剂乳化的疫苗平均抗体水平次之，且在28d达到较高水平值2.7(1：512)，28d以后下降明显，IMS1313降幅比ISA206佐剂疫苗大，这与该佐剂的剂型有关[8]，由于纳米颗粒佐剂疫苗为水溶性物质，虽然能较快的产生抗体，但缓释和控释的作用较弱[9]，HA凝胶佐剂疫苗90d内无明显变化，IgG抗体水平均最低，不能很好的达到免疫效果。比较四种佐剂，自制纳米乳佐剂M12乳化的疫苗平均抗体效价最高且长效[10，11]。