PCR 技术及其在食品微生物检测中的应用

徐知明

（深圳市通量检测科技有限公司，广东深圳 518102）

与其他食品微生物检测领域所应用的检测技术相比，基于PCR 的检测技术具有较高的精确度与可靠性，有利于食品微生物检测工作的开展。PCR 技术在食品微生物检测中的应用能更加快速且真实地了解食品中的致病菌情况，评估病原微生物类型，为后续相关工作的开展奠定基础[1]。更为关键的是，通过对PCR 技术的合理应用，能够准确推断食品在生产后阶段内微生物的繁殖量以及繁殖速度，从而使食品安全检查工作的开展更具预见性与针对性[2]。以下就PCR 技术在食品微生物检测领域中的应用进行分析。

1 PCR 技术

PCR 技术应用于食品微生物检测过程中，通过高温变性 低温退火 中温延伸的方式，完成对食品样本微生物核酸序列的检测，并进行核酸扩增反应。对于被检测食品样品而言微生物处于双链状态的DNA 序列于94.0 左右的高温状态下进行变性反应，并以双链的方式存在，在高温变性基础之上，55.0 左右时特异性引物与模板DNA 单链互补序列配对结合；72.0 左右，以被检测食品样品微生物引物的引导延伸为基础进行复制处理，并实现对微生物DNA 序列的检测。在PCR 检测过程中，上述反应反复发生，最终获取充足的被检样品中微生物DNA 序列，从而得出准确的检测结果。

目前，PCR 技术在食品微生物检测中的应用以荧光定量PCR 技术为主，该技术在检测过程中通过对微生物基因的标记来分析DNA 数量。为确保荧光定量PCR 技术在微生物检测领域得到可靠应用，就需要高度重视受体发色团偶极-负极间的相互关系，并通过能量转移的方式，使供体发色基因-受体发色基因在荧光表现上呈现出较强的差异，在此基础上使DNA 产生数量与荧光强度呈正相关。具体操作中，检测人员需要对靶序列初始浓度进行准确记录，根据参与反应荧光浓度的实测值得到准确的检测结论。相关报道中指出，PCR 荧光定量技术能够准确反映出待测食品样品中所含微生物，同时掌握基因标记与基因复制的相关内容。这样一来，即便食品样品中所含微生物数量有限，仍然可以通过对初始浓度进行标记与记录的方式获取可靠的检测结果。且相较于其他检测技术，基于荧光定量的PCR 技术在具体实施中有较高的自动化水平，检测结果准确性高，整个操作过程简单可控，对我国当前的食品环境市场而言有较高的适用性。

2 基于PCR 技术的食品微生物检测方法

PCR 技术在食品微生物检测领域中的应用相当普遍，PCR 技术的合理应用为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及绿脓杆菌等食品领域常见微生物检测提供了可能性[3]。以金黄色葡萄球菌为例，该菌种在新鲜蔬果中的繁殖速度非常快，尤其是对于存放有一定时间的蔬果，表面金黄色葡萄球菌的繁殖速度极快，其代谢产物肠毒素会对人体产生非常大的影响，甚至可能导致食物中毒事件的发生。因此，在食品微生物检测中必须高度重视对该指标的检测，科学确定该菌种以及类似菌种的分布情况，最大限度排除其对人体安全所产生的不利影响。而在这一背景下， PCR 技术能够实现对被测食品样品中微生物的可靠检测，保障检测精度符合要求。食品生产企业可以尝试将基于PCR 技术的微生物检测引入产品出厂检验环节，避免不合格食品流入市场。所涉及的微生物检测方法有以下几种类型。

2.1 普通PCR 检测方法

普通PCR 检测法是食品微生物检测中应用最为广泛的检测方案。检测期间，将一定比例聚合酶添加至混合物中，可形成检测所需的基础样本。后续检测期间，还应当对反应条件以及环境温度进行预设，并展开针对基础样本的处理反应。在温度可控的条件下，混合物由于添加有一定比例的聚合酶，容易导致目标物质产生扩增反应[4]。基础样本检测期间高温变性是指在加热条件下，经过一段时间模板DNA解离成为易与引物结合的单链；低温退火为DNA 片段成单链后降温，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；延伸为DNA 模板-引物结合物在经聚合酶的作用，按碱基互补配对与半保留复制原理，复制DNA。上述3 个过程可不断重复，得到更多的半保留复制链，为下次复制过程提供模板。上述循环过程反应迅速，2 ～3 h 可得到几百万条DNA，以满足食品检测需求。

2.2 多重PCR 检测方法

多重PCR 检测技术是以常规PCR 检测方法为基础进行改进与优化所得。常规PCR 检测方法从本质上来说是基于单引物的检测，而多重PCR 检测技术则实现了对多个DNA 引物的检测。对于相同的PCR 反应体系，通过投加≥2 个反应引物的方式，受聚合酶影响产生扩增与复制。需要注意的是，本方法用于微生物检测时，反应前投加2 个或2 个以上DNA 引物，因而在聚合酶作用下能够生成多个相对应的DNA 反应片段，在应用于食品微生物检测中时，能够就微生物的致病因子展开系统分析[5]，这对于微生物检测结果准确率的提升是非常关键的。且本方法实施过程中所分析致病因子明显较传统方法更多，检测效率较高。目前，多重PCR 检测技术能够缩短检测时间、减少检测内容遗漏风险，促进检测结果准确率的提升，且对样本投入量有一定的控制效果，可通过多基因检测的方式获得较高的经济效益。

2.3 定量PCR 检测方法

定量PCR 检测技术是在常规PCR 检测方法的基础上变形得到，操作原理及步骤上与传统PCR 方法存在一定差异，但将其应用于食品微生物检测中时能够表现出突出的优势。应用本方法检测食品样本中微生物的基本原理是对细胞组织中总DNA进行提取，将mRNA 作为检测模板，选择随机引物并通过逆转录酶反应的方式转录形成cDNA。在此基础上，形成cDNA 模板并对其进行扩增处理，以此种方式获得检测基因及其表达。相较于传统的PCR 检测技术，定量PCR 检测技术尝试将待检测食品样本目标中的一条RNA 先进行逆转录处理，得到互补DNA，使后续的扩增以及复制处理具有针对性。为确保检测结果的可靠性，在本检测方法实施期间必须注意确保参与逆转录反应的DNA 模板的完整性，且剔除其他蛋白质或杂质的影响，保障基因链的完整性。本检测方法可以尝试与数字技术以及荧光技术相结合，提高检测过程的灵敏度，以便获取更高精准度的检测结果。

3 PCR 技术在食品微生物检测中的应用

近年来，PCR 技术已经在食品微生物检测领域得到广泛应用，在食品致病菌、乳酸菌以及水源细菌的检测等环节中发挥出了一定的优势。

3.1 食品致病菌检测

以往针对食品致病菌展开的检测手段存在一系列问题，检测过程耗时长且操作步骤烦琐，难以保障检测工作的开展效率。且为得到可靠的检测结果，常需要对被检测微生物进行富集培养处理，确保食品检测样品中微生物数量达到可供检测水平后方可进行样品微生物分离处理，进而对微生物具体形态特征进行鉴定。由此可见，传统检测方法不但需要人工进行微生物培养，且培养期间不确定因素较多，导致微生物检测难度较大。而PCR 技术的应用能够突破传统检测技术存在的诸多限制，通过对细菌编码rRNA 进行扩增以及赋值处理的方式，获取微生物致病菌检测所需的DNA 片段，并能全面了解致病菌的存在情况。除此以外，基于PCR 技术的应用还能够对难以进行人工培养的微生物进行扩增处理，获取准确的DNA 片段，从而得到可靠的检测结果。

3.2 水源指示细菌检测

水质同样会对人们的身体健康产生影响，食品行业大量产品对水质要求较高，对水源指示细菌进行检测有重要价值。以往针对水质的细菌检测以大肠埃希菌为关键指标，使用传统检测方法需要几天时间，耗时耗力，且检测结果的准确性难以保障。若能够通过利用 -半乳糖苷酶的方式，明确底物并进行检测，则能够显著提高检测结果的准确性与工作效率。但需要注意的是，部分大肠杆菌品系对 -葡萄糖醛酸苷酶的表达效果较差，难以保障检测结果的可靠性。而PCR 技术可以面向 -半乳糖苷酶以及 -葡萄糖醛酸苷酶基因提供更加可靠与有效的检测方案，相较于传统方法具有更强的灵敏度以及特异性，且能够在检测过程中进行扩增处理，以实现对多种类型大肠杆菌的可靠检测，同时缩短检测时间，提高检测效率。以沙门氏菌为例，其作为寄生在人类以及动物肠道组织中的典型微生物，属于革兰氏阴性杆菌，生化反应与人体抗原结构存在密切关系。若不及时发现水源污染并进行针对性处理，可能导致一系列疾病的产生。需要注意的是，沙门氏菌虽然毒性水平偏低，但在菌体裂解反应过程中会产生毒性水平较高的内毒素，并侵入宿主细胞，进而对人体健康产生影响。目前PCR 技术的应用过程中，有关沙门氏菌的检测可以将invA、invb、hila以及16S rRNA 作为主要靶基因。

3.3 乳酸菌检测

以典型的双歧杆菌为例，有研究尝试对双歧杆菌现有种以及相关种所对应基因序列进行对比分析，结果显示位于1 412 ～1 432 位的寡核苷酸碱基序列有高度一致性表现，提示其可以作为双歧杆菌特异性较高的寡核苷酸片段，通过对PCR 技术的应用，可以将其作为引物并对双歧杆菌16S rRNA 基因片段进行扩增处理。在此过程当中，模板DNA 通过简单SDS 裂解细菌细胞并经蛋白酶对蛋白进行去除处理后获得。在这一背景下，双歧杆菌能够基于PCR 技术进行扩增处理的方式产生具有典型特征的1.35 kb核苷酸片段，并以其为基础展开PCR 检测，确保检测结果的可靠性。

4 结语

在食品安全领域中，对食品微生物进行可靠检测是非常重要的工作内容，在此期间应用PCR 技术的综合优势非常明显。在PCR 技术的应用过程中，相关人员必须形成正确的技术应用认知，结合微生物检测实际需求制定完善的PCR 技术方案，并通过有效措施促进食品微生物检测工作质量的提高，将PCR 技术作用充分发挥出来，根据微生物检测结果及时发现食品安全问题并积极展开后续应对与处理工作。本文通过分析PCR 技术在食品微生物检测中的应用及相关原理介绍，希望为食品质量安全的保障奠定基础。