磁性荧光免疫纳米探针的制备及检测应用

2023-09-19刘一丹左显维韩根亮宋玉哲

西北师范大学学报（自然科学版） 2023年5期

刘一丹，左显维，韩根亮，宋玉哲，王焱

(甘肃省科学院传感技术研究所，甘肃省传感器与传感技术重点实验室，甘肃兰州 730000)

免疫球蛋白G(IgG)是人体血清中含量最高的抗体，它由免疫反应部分的B淋巴细胞产生，占血清中免疫球蛋白的70%～80%，具有抗菌、抗病毒、抗毒素的特征，在机体免疫防护中起重要作用[1-4].鉴于IgG是诊断慢性感染、慢性肝病、免疫性疾病的一个特异性临床指标，因此测定人血清中IgG的含量可对许多疾病的早期诊断提供依据.

目前，检测 IgG 的主要方法为酶联免疫分析技术(ELISA)，然而标记酶需要特别的保存，且传统的ELISA采用比色法检测，灵敏度和准确性有待进一步提高[5].利用特定生物分子之间的特殊亲和力和特异性，包括抗体-抗原、受体-配体DNA-蛋白质等的相互作用，已经开发出了一系列敏感和高选择性的生物检测探针[6].而荧光免疫探针基于抗原抗体结合的免疫反应，将物质的荧光作为输出信号实现定量检测，体系兼具免疫反应的特异性和荧光响应的高灵敏度.在众多荧光检测体系中，荧光共振能量转移(FRET)体系备受关注，它对供体和受体之间的分离距离极其敏感，其中发光供体通过非辐射偶极子-偶极子相互作用将能量转移到荧光或非荧光受体，当生物亲和反应使其接近时，就会在两个荧光团之间发生FRET[7-8].因而在单分子光谱[9]、蛋白质折叠[10]、细胞成像[11]和免疫分析[12]中有广泛的应用.

纳米材料具有独特的结构和性能，其与生物分子偶联构建的新型纳米探针，可极大地提高生物探针的性能.将生物分子偶联在具有生物相容性的纳米磁性材料表面，可以通过磁场将其从复杂基质中分离，从而减小背景信号，为生物分子的检测提供了简便的方法.磁性纳米材料已广泛应用于免疫分析[13-14]、酶固定化[15]等生化领域，如蛋白质的检测[16]、核酸杂交[17]和端粒酶活性检测[18].然而磁性材料与IgG结合时普遍会面临一个问题，即磁性材料与IgG进行非特异性结合，使固定的抗体分子取向不一致，影响抗体的靶向效率.蛋白G是G型链球菌分离而得到的细胞壁蛋白，可以与IgG的补体端(Fc端)以高亲和力特异性结合，特别对人、兔和鼠的IgG表现出很高的亲和力[19-20].由于蛋白G能够特异性识别IgG的Fc端，因此，通过蛋白G的连接，可以将抗体分子定向固定在磁性材料上，使抗原结合部位(Fab)充分暴露，有利于分析物的结合，因此提高检测灵敏度，降低检出限.

鉴于此，在聚丙烯酸(PAA)修饰的Fe3O4磁性纳米团簇上连接蛋白G，从而在其表面定向固定抗体，并利用荧光团/淬灭剂对距离依赖性光学特性，设计分别标记荧光团和淬灭剂的抗原-抗体偶联复合物，制备出基于FRET原理的磁性荧光纳米免疫探针，并利用此探针与目标物IgG的竞争性免疫反应，建立了灵敏、快速检测IgG的新方法.PAA中的羧基可与蛋白G的氨基连接，提高连接效率和强度.将这种羧基化磁性纳米团簇与蛋白G的复合材料用于抗体的定向固定，抗体活性Fab部分充分暴露在外侧，极大地提高了抗体的结合效率.而小尺寸的纳米团簇可以起到信号放大作用，从而提高检测灵敏度.

1 实验部分

1.1 实验试剂

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、2-吗啉乙磺酸(MES)均为分析纯，购自美国 sigma-aldrich公司；重组蛋白G(protein G)、牛血清蛋白(BSA)，纯度>98%，购自美国 sigma-aldrich公司；人免疫球蛋白G(IgG)、4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸标记羊抗人免疫球蛋白G(DABCYL-anti-IgG)、荧光素二乙酸酯标记人免疫球蛋白G(FAM-IgG)购自北京博奥森生物技术有限公司；灭菌去离子水.纳米团簇的洗涤和活化缓冲液为0.05 mol·L-1MES溶液(pH=6.0)，培养免疫复合物的缓冲液为含0.1 mol·L-1NaCl 的 0.01 mol·L-1磷酸盐(PBS, pH=7.4).

1.2 磁性荧光免疫纳米复合探针的制备

利用Discover SP型单模微波合成仪(美国CEM公司)，通过微波辅助多元醇法制备得到聚丙烯酸修饰的磁性纳米团簇(PAA-Fe3O4NCs)[21].取500 μL 10 mg·mL-1磁性纳米团簇分散液到离心管中进行磁分离，用0.05 mol·L-1MES(pH=6.0)缓冲液洗涤3次后，加入500 μL 10 mg·mL-1EDC，室温孵育50 min，以活化羧基.在活化后的磁性纳米团簇中加入200 μL 1 mg·mL-1蛋白G，室温孵育3 h，磁分离弃去未连接的蛋白G，用MES缓冲液洗涤后，重新分散在含1.0 % BSA的PBS中，然后在室温下孵育2 h，以消除非特异性结合，磁分离除去多余的BSA.洗涤后加入500 μL 0.16 mg·mL-1荧光淬灭剂标记的羊抗人免疫球蛋白G (DABCYL-anti-IgG)，室温下孵育24 h，得到Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG.洗涤后再次分散在含1.0 % BSA的PBS中，在室温下孵育2 h，以消除非特异性结合，并进行磁分离.最后用0.01 mol·L-1PBS(pH=7.4)缓冲液洗涤3次，在4 ℃下储存待用.吸取12 μL 2.5 mg·mL-1FAM-IgG和488 μL PBS，加入到Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG的PBS溶液，混合均匀后，在37 ℃下孵育1 h，得到磁性荧光免疫纳米复合探针(Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG-IgG-FAM).

1.3 血清样品的制备

随机留取门诊患者的血液样本，利用H1650型台式高速离心机(湖南湘仪)离心15 min(4000 r·min-1)获得血清，然后在-20 ℃保存，进行分析前用0.01 mol·L-1PBS(pH=7.4)缓冲液稀释.

1.4 人免疫球蛋白G的检测

采用FS5型一体化稳态瞬态荧光光谱仪(英国爱丁堡公司)测定荧光强度，激发和发射波长分别为490和517 nm.用荧光光谱仪检测磁性荧光免疫纳米复合探针的初始荧光强度.将过量的免疫复合探针分为8等份，分别加入不同浓度梯度(0.06,12.00,45.60,70.70,110.00,146.00,180.00,210.00 nmol·L-1)的IgG标准液或样品液，在37 ℃下孵育3 h，进行免疫竞争反应.随后将磁性荧光免疫纳米复合探针通过磁分离，测定上清液的荧光光谱.

2 结果与讨论

2.1 竞争性免疫反应的检测原理

竞争性免疫反应的检测原理见图1.在羧基化的磁性纳米团簇(Fe3O4NCs)表面修饰蛋白G，用于定向连接荧光淬灭剂标记的羊抗人免疫球蛋白G(DABCYL-anti-IgG)，制得荧光淬灭剂标记的羊抗人免疫球蛋白G修饰的Fe3O4磁性纳米团簇；将它与FAM荧光素染料标记的人IgG(FAM-IgG)混合后，磁性纳米团簇上的抗体与IgG特异性结合，FAM荧光团与荧光淬灭基团DABCYL靠近，发生荧光共振能量转移，FAM的荧光淬灭；当加入目标检测物IgG时，IgG与FAM-IgG竞争结合磁性纳米团簇上的抗体[22]，因此磁性纳米团簇上的FAM-IgG减少，发生FRET的荧光强度减少，而磁分离后上清液荧光信号增强；随着IgG加入量的增多，竞争免疫反应持续发生，上清液中荧光信号不断增强，IgG与荧光信号响应成正比，从而定量检测IgG.

图1 磁性荧光免疫纳米探针的制备及检测原理

2.2 磁性荧光免疫纳米复合探针的表征

2.2.1 羧基化Fe3O4磁性纳米团簇(Fe3O4NCs)的表征采用透射电镜、X射线衍射和红外光谱表征合成的羧基化Fe3O4磁性纳米团簇的微观形貌和结构组成，结果见图2.从透射电镜(图2a)中看出，纳米团簇是由许多很小的Fe3O4纳米颗粒组装而成，平均粒径约30 nm，背景干净清晰，团簇分布均一.材料的XRD见图2b所示，其与反尖晶石型 Fe3O4(JCPDS.19-0629)标准衍射谱吻合，表明团簇由Fe3O4纳米颗粒组成.另外，在衍射角为20.0°左右的位置出现了无定形的聚合物包峰，说明在Fe3O4纳米团簇表面有聚合物的包覆.图2c为羧基化磁性纳米团簇的傅立叶变换红外(FT-IR)光谱，602 cm-1处出现的峰归属于Fe-O键的伸缩振动峰，此为Fe3O4的特征峰.3 400 cm-1处的宽峰为—OH的伸缩振动峰，1 663 cm-1处的峰为C=O的伸缩振动峰，这2个峰的出现说明样品中存在羧基，且羧基上的2个氧原子与Fe结合后发生红移.2 948 cm-1处的峰为聚丙烯酸主链上—CH2—的反对称伸缩振动峰，进一步证实聚丙烯酸(PAA)的存在，说明PAA成功修饰在Fe3O4纳米团簇表面，它们极易与蛋白之间发生化学偶联、静电吸附、氢键等相互作用.

图2 羧基化Fe3O4磁性纳米团簇(Fe3O4NCs)的透射电镜(a)，X射线衍射(b)和红外光谱(c)

2.2.2 蛋白G修饰的Fe3O4磁性纳米团簇(Fe3O4NCs-protein G)的表征图3A为Fe3O4NCs与Fe3O4NCs-protein G的Zeta电位对比图，可以看出Fe3O4纳米团簇表面由于存在羧基，Zeta电位呈负性(a曲线)；而包覆蛋白G后Zeta电位向更负方向移动(b曲线)，这是由于蛋白G分子中含有很多活性基团.图3B为Fe3O4纳米团簇与蛋白G包覆Fe3O4纳米团簇的磁滞回线对比，从图中可以看出，Fe3O4纳米团簇包覆蛋白G后饱和磁化强度减弱(b曲线)，这是由于随着蛋白G的引入，导致Fe3O4磁性粒子的含量降低，从而造成饱和磁化强度下降，从侧面证明蛋白G已成功包覆.

图3 Zeta电位(A)(a为Fe3O4NCs，b为 Fe3O4NCs-protein G)和磁滞回线(B) (a为Fe3O4NCs, b为Fe3O4NCs-protein G)

2.2.3 荧光淬灭剂标记的羊抗人免疫球蛋白G修饰的Fe3O4磁性纳米团簇(Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG)的表征图4为探针制备过程中在Fe3O4磁性纳米团簇表面修饰蛋白G和抗体的Zeta电位.由图可见，随着磁珠表面蛋白G和DABCYL-anti-IgG的连接，Zeta电位逐渐向负方向移动，说明带负电的活性基团越来越多，这与实验过程一致，证明Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG成功制备.

图4 磁性纳米团簇表面修饰蛋白G和抗体的Zeta电位(a Fe3O4NCs,b Fe3O4NCs-protein G,c Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG)

2.2.4 磁性荧光免疫纳米复合探针(Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG-IgG-FAM)的表征图5为FAM荧光素标记的人免疫球蛋白G修饰的Fe3O4磁性纳米团簇(Fe3O4NCs-protein G-IgG-FAM)与磁性荧光免疫纳米复合探针(Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG-IgG-FAM)的荧光显微镜图.如图5a所示，Fe3O4NCs-protein G-IgG-FAM有荧光出现，说明标记有FAM荧光素染料的IgG成功连接在蛋白G上，实现了蛋白G对抗体的连接；但当FAM-IgG与Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG发生免疫反应形成磁性荧光免疫纳米复合探针Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG-IgG-FAM后，由于荧光淬灭剂DABCYL与荧光供体之间发生荧光共振能量转移，磁性荧光免疫纳米复合探针的荧光明显被淬灭(图5b).说明磁性荧光免疫纳米复合探针Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG-IgG-FAM已制备成功.

图5 荧光显微镜图(a Fe3O4NCs-protein G-IgG-FAM， b Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG-IgG-FAM

2.3 磁性荧光免疫纳米复合探针检测IgG的原理验证

图6为磁性荧光免疫纳米复合探针检测IgG的荧光光谱.曲线a为Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG与FAM-IgG混合后发生荧光共振能量转移后的荧光光谱曲线，荧光被淬灭，几乎没有荧光强度.当加入目标检测物IgG时，IgG与FAM-IgG竞争结合磁性纳米团簇上的抗体，因此磁性纳米团簇上的FAM-IgG减少，磁分离后上清液FAM-IgG荧光信号增强；随着IgG加入量的增多，竞争免疫反应持续发生，上清液中荧光信号不断增强.如图6b,c,d所示，随着IgG加入量的增多，上清液荧光信号不断增强.图6有效证明了磁性/荧光复合免疫探针检测IgG的设计原理.

图6 a Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG-IgG- FAM溶液的荧光光谱，b,c和d加入不同浓度 IgG(42.0,58.0,67.0 nmol·L-1)后发生免疫竞争反应的上清液荧光光谱

2.4 磁性荧光免疫纳米复合探针检测条件的优化

为了得到最佳的检测条件，对检测过程中Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG用量、缓冲液pH值、免疫反应温度和免疫竞争反应时间进行了优化.选用250 μL荧光标记IgG(FAM-IgG)分别与50,100,150,200和250 μL Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG偶联，以优化竞争免疫反应中Fe3O4NCs-proteinG-DABCYL-anti-IgG的用量(图7a).当Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG用量为200 μL，荧光响应趋于稳定，表明其用量已达到饱和.因此，选用200 μL Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG进行后续实验.

图7 反应条件优化(a Fe3O4NCs-protein G-DABCYL-anti-IgG用量，b 缓冲液pH值，c 免疫反应温度，d 免疫竞争反应时间)

抗原抗体免疫反应一般在PBS缓冲液中进行.由于PBS的pH值影响抗体和抗原的活性，免疫竞争反应在pH为5.5～8.5之间进行测试.结果表明(图7b)免疫竞争反应的最佳pH值为7.4.

通常过高或过低的温度都会干扰抗原和抗体的稳定性，而适当的免疫反应温度会促进免疫识别.如图7c所示，在10～45 ℃范围内的孵育温度会引起上清液荧光强度的变化，实验表明37 ℃时荧光信号最强.因此，竞争免疫反应的最佳孵育温度为37 ℃.

竞争免疫反应的孵育时间对上清液荧光强度的影响如图7d所示，当孵育时间小于3 h时，荧光强度随孵育时间的增加而增加，然后随着时间的推移趋于稳定.由图可发现免疫竞争反应时间也不是越长越好，反应时间太长反而会使荧光强度受损，3 h的孵育时间可以保证免疫反应的平衡，因此选择3 h作为最佳孵育时间.

2.5 磁性荧光免疫纳米复合探针检测IgG的性能

图8为加入不同浓度人免疫球蛋白G(IgG)后体系荧光光谱的变化(图8a)和IgG响应的线性曲线(图8b).在发射波长为517 nm时记录各样品的荧光信号，从图8a可以看到，当IgG的浓度逐渐增大时，检测体系的荧光强度也随之增强，这表明该探针对IgG的浓度变化具有很好的响应.从图8b可以看到，IgG的浓度变化与检测体系相对荧光强度变化值呈良好的线性关系，IgG检测的线性范围为0.06～146 nmol·L-1，检测限为0.02 nmol·L-1(S/N=3)，相关系数为0.999 7.

图8 (a)加入不同浓度IgG时荧光强度变化图(IgG浓度从曲线a到曲线f依次为0.06,12.00,45.60,70.70,110.00和146.00 nmol·L-1)，(b)相对荧光强度变化值与IgG浓度线性关系

免疫球蛋白(Ig)是一组具有抗体活性的蛋白质，主要存在于生物体血液、组织液和外分泌液中，是检查机体体液免疫功能的一项重要指标.免疫球蛋白三项指血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM).用IgA和IgM来测试磁性荧光复合免疫探针的选择性，评估其抗干扰能力.如图9所示，只有IgG能明显地引起荧光变化，IgA和IgM没有明显的干扰.结果表明该方法对IgG检测具有良好的选择性，能够将复杂样品中的IgG与其类似物区分开，归因于抗原-抗体免疫反应的高特异性和磁性分离纯化.

图9 干扰物IgM(240.0 nmol·L-1)和 IgA(240.0 nmol·L-1)对IgG(240.0 nmol·L-1) 检测的影响

2.6 实际样品检测

正常人血清中免疫球蛋白G含量在53.33～106.67 μmol·L-1[23].将人血清离心处理(4 000 r·min-1)，用0.01 mol·L-1的PBS缓冲溶液稀释1 000倍，与磁性荧光免疫纳米复合探针在37 ℃下振荡反应3 h，磁分离，分别收集上清液进行检测.用该探针测得3个血清样品中人IgG的浓度分别为50.30,84.23和 61.60 μmol·L-1.另外，采用标准加入法对该探针的可靠性进行评估，检测结果见表1，测得加标回收率为92.3%～95.6%.将各血清样品在1个工作日内重复分析3次，相对标准偏差为0.8%～2.2%.综上说明该磁性荧光复合免疫探针可以用于血清中IgG的检测.