HPLC-DAD 法同时测定当归祛风合剂中6 种成分

2023-09-19方应权祝守敏

中成药 2023年9期

谢寒，明荷，方应权，祝守敏

（1.重庆三峡医药高等专科学校附属医院，重庆 404000；2.重庆三峡医药高等专科学校，重庆 404120）

当归祛风合剂是重庆三峡医药高等专科学校附属医院杨炳川主任药师研发的中药制剂，由当归、生地、白芍、白鲜皮、黄芪、防风、甘草等药材组成，结合局部的细火针用于治疗血虚风燥型神经性皮炎，多年临床实践表明其疗效确切。方中当归、生地为君药，调养营血、滋阴生津以治本［1-2］，其中前者有效成分阿魏酸具有抗炎、补血活血等功效［3-4］，而后者活性成分毛蕊花糖苷具有抗氧化、提高免疫力作用，可降低神经性皮炎小鼠模型中的整体搔抓行为、新皮疹发生率［5-6］；白芍、白鲜皮、黄芪为臣药，功效清热燥湿、祛风解毒、益气固表［7-10］，其中白芍是治疗血虚风燥证神经性皮炎的常用中药［7-8］，芍药苷是其主要有效成分，具有抗炎、免疫调节作用［11-12］，白鲜皮所含白鲜碱具有收缩血管平滑肌、抗炎、抗氧化作用［13-14］；防风、甘草为佐使药，调和诸药，使全方共奏活血、止痛、止痉功效［15-16］，并且前者所含升麻素苷、后者所含甘草苷均具有抗炎作用［16-17］。

目前，尚未开展对当归祛风合剂质量控制的系统研究，也未对其进行有效成分含量测定。因此，本实验采用HPLC-DAD 法同时测定阿魏酸、毛蕊花糖苷、芍药苷、白鲜碱、升麻素苷、甘草苷的含量，以期为该制剂进一步开发利用、质量控制、临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱系统，配置G1315B 二极管阵列检测器（美国Agilent 公司）；艾本德5430R 离心机（德国艾本德公司）；BP211D 电子天平（德国赛多利斯公司）；D1810C纯净水蒸馏器（上海申生科技有限公司）；KQ-300DE 型医用超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物阿魏酸（批号121007-211506，纯度99.4%）、毛蕊花糖苷（批号111621-211817，纯度95.2%）、升麻素苷（批号111522-200406，纯度96.5%）、甘草苷（批号111609-211907，纯度95.0%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；芍药苷对照品（批号23180-61-8，纯度≥98.5%）购自北京北纳创联生物技术研究院；白鲜碱对照品（批号MUST-21082203，纯度≥98%）购自成都曼思特生物科技有限公司。当归、生地、白芍、白鲜皮、防风、甘草、黄芪均购自重庆中药材有限公司，经三峡中药研究所付绍智教授鉴定为正品，均符合2020 年《中国药典》规定。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为重蒸水（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Ultimate C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相0.1% 磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～35 min，20%～42%B；35～40 min，42%～85%B；40～60 min，85% B）；体积流量1.0 mL／min；柱温35 ℃；检测波长280 nm （阿魏酸）、334 nm （毛蕊花糖苷）、230 nm （芍药苷）、236 nm （白鲜碱、甘草苷）、240 nm （升麻素苷）；进样量20 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取各对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，作为贮备液，分别精密吸取适量，置于同一25 mL 量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，即得（各成分质量浓度分别为白鲜碱 8.89 μg／mL、甘草苷 230.84 μg／mL、芍药苷604.82 μg／mL、升麻素苷75.24 μg／mL、阿魏酸36.17 μg／mL、毛蕊花糖苷25.12 μg／mL）。

2.2.2 供试品溶液精密量取本品1 mL，置于50 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，超声（500 W、50 Hz）处理30 min，静置至室温，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液按本品处方比例，分别制成缺白鲜皮（白鲜碱）、缺甘草（甘草苷）、缺白芍（芍药苷）、缺防风（升麻素苷）、缺当归（阿魏酸）、缺生地（毛蕊花糖苷）的阴性样品，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰分离情况良好（分离度＞1.6），理论塔板数按各成分色谱峰计，均大于2 700，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig．1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，制成系列质量浓度，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y）对其质量浓度（X）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab．1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验精密吸取同一份对照品溶液20 μL （含白鲜碱 0.89 μg／mL、甘草苷 23.08μg／mL、芍药苷60.48 μg／mL、升麻素苷7.52 μg／mL、阿魏酸3.62 μg／mL、毛蕊花糖苷2.51 μg／mL），在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得测得白鲜碱、甘草苷、芍药苷、升麻素苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面积RSD 分别为2.12%、1.86%、2.51%、1.17%、3.06%、3.87%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验取同一份本品（批号20211012），按“2.2.2 ” 项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得白鲜碱、甘草苷、芍药苷、升麻素苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面积RSD分别为3.12%、2.56%、2.26%、2.73%、3.61、4.08%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验取同一份本品（批号20211012），按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得白鲜碱、甘草苷、芍药苷、升麻素苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面积RSD 分别为3.20%、1.71%、2.29%、2.85%、3.76%、3.82%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验精密吸取本品（批号20211012） 0.5 mL，加入“2.2.1” 项下对照品溶液2.5 mL，按“2.2.2” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，白鲜碱、甘草苷、芍药苷、升麻素苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷平均加样回收率分别为101.15%、100.50%、97.41%、95.56%、105.29%、98.93%，RSD 分别为3.92%、2.77%、3.83%、2.80%、3.64%、3.64%。

2.9 样品含量测定取3 批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定3 次，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果（μg／mL，n＝3）Tab．2 Results of content determination of various constituents （μg／mL，n＝3）

3 讨论

3.1 检测指标选择本实验根据相关文献报道、前期预实验结合HPLC-DAD 仪器特点，选择各药材中既有药理活性，含量又较高的白鲜碱、甘草苷、芍药苷、升麻素苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷进行含量测定。另外，黄芪常以黄芪甲苷为指标［18］，采用蒸发光散射检测器进行测定［19］，但无法与本实验方法统一，故未纳入该成分。

3.2 色谱条件选择本实验所测6 种成分的紫外吸收差异较大，故采用DAD 检测器在190～400 nm波长处扫描以确定最大吸收波长，并选择多波长切换模式，使其均有较大的吸收值，并使测定方法更灵敏、准确、实用。然后，在相关文献报道、前期预实验基础上，本实验分别考察了以一定体积分数甲酸、磷酸、磷酸盐缓冲液、三氟乙酸溶液为水相，甲醇或乙腈为有机相的流动相，最终确定为0.1%磷酸-乙腈梯度洗脱，此时分析时间短，各成分分离度、理论塔板数符合要求。