微生物胞外多糖结构与活性研究进展

李春雨，屈建航，周佳

（河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001）

多糖通常是由十几种单糖通过糖苷键连接并组合而形成的复杂结构高分子聚合物，是生命组成的四大基本物质之一[1]。微生物多糖是一类丰富且重要的化合物，主要由细菌、真菌和藻类分泌。根据多糖在细胞中的不同位置，可以分为胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）、胞壁多糖和胞内多糖三大类[2]。微生物胞外多糖是一些特殊微生物通过碳源的吸收同化在细胞内产生并分泌到细胞壁外的聚合物，属于微生物的次级代谢产物。胞内多糖和胞壁多糖产量低，成分复杂，杂质多，提取纯化不易，相比之下，微生物胞外多糖生产周期短，易分离纯化，具有更高的经济效益[3]。

胞外多糖是微生物产生的重要代谢物，这些EPS分子主要负责生物膜的形成，也参与细胞防御机制，保护菌体免受外界环境压力[4]。大量研究表明，微生物EPS 具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血糖、乳化、絮凝等多种生物活性[5]，除此之外，微生物EPS 不仅是天然化合物，而且属于可再生可持续发展的资源，应用范围非常广泛，其中普鲁兰多糖、结冷胶及黄原胶等多个产品已应用于医药、食品、化工等多个领域[6]。

微生物EPS 的来源不同，其结构与功能也各不相同。因此，本文对微生物胞外多糖的结构表征及生物活性进行归纳总结，并探讨二者之间的构效关系，以期为微生物EPS 在食品、药品、化工等领域的研究与应用发展提供思路和理论依据。

1 微生物胞外多糖的结构

1.1 初级结构

微生物胞外多糖的结构分为初级（一级）结构和高级（二、三、四级）结构。初级结构主要包括胞外多糖的分子量、单糖组成及比例、异头碳构型、糖苷键类型、糖链中糖基排列顺序和分支情况、单糖残基上的羟基取代状况等[7]。对于多糖一级结构的分析方法主要分为物理、化学和生物学三大类，如表1 所示。通常采用色谱法测定分子量（高效液相色谱或凝胶排阻色谱）和单糖组成及比例（气相色谱或液相色谱），采用红外光谱法对异头碳构型进行分析，采用甲基化和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）对单糖连接次序以及化学基团等进行表征分析。

表1 胞外多糖初级结构分析方法Table 1 Methods for primary structure analysis of exopolysaccharides

目前，已报道的产胞外多糖的微生物主要有乳杆菌（Lactobacillus sp.）[8]、芽孢杆菌（Bacillus sp.）[5]、魏斯氏菌（Weissella sp.）[9]、明串珠菌（Leuconostoc sp.）[10]、发酵乳酸杆菌（Limosilactobacillus sp.）[11]肠球菌（Enterococcus sp.）[12]、毛霉（Mucor sp.）[13]、小球藻（Chlorella sp.）[14]等，这些多糖种类繁多、结构复杂，通常采用多种方法综合运用，解析多糖的结构，具体表征方法及研究结果如表2 所示。

表2 胞外多糖初级结构研究进展Tab le 2Rese arch progres s in primary structures of exop olysaccharides

1.2 高级结构

多糖结构的研究晚于蛋白质和核酸，且多糖结构比蛋白质和核酸的结构更加复杂，目前关于微生物EPS高级结构的研究尚处于起步阶段。Vinothkanna 等[21]通过原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）在分子水平上直接观察到地衣芽孢杆菌AG-06 EPS 在分子间、分子内聚集，形成球形团块和链状特征且球形结构的尺寸远大于链状多糖。徐渊美[22]通过刚果红试验检测植物乳杆菌KX041 EPS-3 是否具有三螺旋构象，结果显示在弱碱环境下，EPS-3 与刚果红聚合物产生了红移，表明其具有三螺旋结构。除此之外，还可通过扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）、X-射线衍射（X -ray diffraction，XRD）、 圆二色谱（circular dichroism，CD）、分子模拟技术等方法对多糖高级结构进行表征[23-24]。目前国内外关于解析胞外多糖高级结构的相关报道较少，这主要与多糖结构复杂、解析难度高、解析技术水平相对有限等原因有关。

2 胞外多糖的活性

2.1 抗氧化活性

自由基和活性氧在人体的新陈代谢活动中发挥着重要的调节作用，但含量过高时会产生氧化应激反应，使细胞膜破坏、核酸断裂、蛋白质损坏等，进而引发氧化应激性相关疾病[25]。清除氧活性化自由基是抗氧化药物发挥其药效的一个重要途径。目前食品工业中广泛应用的抗氧化剂主要有没食子酸酯、丁基羟基茴香醚、2，6-二叔丁基甲酚、三羟基苯丁酮等，这些抗氧化剂均是合成的，不仅具有一定毒性而且生产成本高，因此对天然抗氧化剂的研究和开发受到了国内外研究者的广泛关注[26]。

许多研究表明，微生物EPS 具有较好的抗氧化能力，能减轻自由基等对机体造成的氧化损伤。通过自由基清除和还原力测试的方法，研究发现来自细菌[27-28]、真菌[29]、藻类[30]等微生物的胞外多糖都具有自由基清除能力和还原能力，且表现出较好的抗氧化活性。除此之外，胞外多糖还可改善细胞抗氧化的能力。Wang等[31]探究了球毛壳菌CGMCC 6882 EPS 对巨噬细胞抗氧化的影响，结果表明该多糖可通过增强巨噬细胞内抗氧化酶（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶）的活性和总抗氧化能力以及减少丙二醛的含量显著提高细胞的活力。Wang 等[32]研究了发酵乳杆菌S1 的EPS对秀丽隐杆线虫抗氧化的影响，结果表明，该EPS 可显著提高线虫体内总抗氧化能力和超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛含量水平，显著改善线虫体内抗氧化状态。这些研究结果表明，微生物EPS 有可能成为一种天然抗氧化剂在食品、药品等行业中应用。

2.2 抗肿瘤活性

癌症是主要公共卫生问题之一，癌细胞是恶性肿瘤中最常见的一类。大量研究表明，EPS 具有抗肿瘤活性，其作用机制主要分为两种：一种是直接作用于肿瘤细胞，直接诱导肿瘤细胞分化和凋亡等；另一种是作用于宿主细胞，通过提高宿主的免疫功能抑制肿瘤细胞生长或杀死肿瘤细胞[33]。

大量研究报道了微生物EPS 的抗肿瘤活性。海洋芽孢杆菌EPS 浓度超过50 μg/mL 时具有显著抑制HeLa 细胞增殖的作用[34]。副干酪乳杆菌EPS 对Caco-2细胞作用72 h 时的抑制率达到19.5%（500 μg/mL），该EPS 可通过影响Caco-2 细胞凋亡相关蛋白的表达直接促进肿瘤细胞凋亡[35]。低剂量粒毛盘菌胞外多糖硒纳米颗粒可有效抑制小鼠肿瘤生长及肿瘤细胞的增殖，除此之外，可增加血清中的免疫因子白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-1-β、γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ） 和肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）的质量浓度，继而激活抗肿瘤免疫系统抑制肿瘤的生长[36]。深海细菌EPS 对肝癌细胞Bel-7402 和Huh7.5 均具有较好的生长抑制作用，对两种细胞系的抗肿瘤作用的IC50为0.4～0.5 mg/mL，构建抗肿瘤模型发现，该EPS 通过靶向FGF19-FGFR4 信号通路发挥抗肿瘤作用[37]。真菌胞外多糖羧甲基化后，降低了MCF-7 细胞的增殖，降低细胞形成菌落和在细胞外基质中迁移的能力[38]。

2.3 抗炎症活性

炎症因子的过度表达会造成细胞、组织、器官的损伤，甚至会促使肿瘤生长，因此消除炎症因子并恢复免疫稳态对保护机体具有重要意义。EPS 可起到抑制感染，预防和治疗炎症的作用，一般是通过调节炎症信号分子来调节免疫系统的应答反应，从而发挥其抗炎症活性[39]。

EPS 的抗炎活性研究主要以巨噬细胞等免疫细胞为载体，Zhang 等[40]从沼泽红假单胞菌提取胞外多糖，体外免疫试验表明，其EPS 可激活巨噬细胞的吞噬能力，并且可以促进肠道有益菌群的生长。周兴涛[41]研究发现，植物乳杆菌NCU116 EPS 可减轻右旋糖酐硫酸钠诱导的小鼠结肠炎症，机制探究结果表明，EPS 可促进紧密连接蛋白的表达调节转录因子STAT3 信号通路，调节肠道黏膜屏障功能，从而减轻炎症。房晓彬[42]发现，植物乳杆菌EPS103 对巨噬细胞RAW264.7 具有双重体外免疫调节作用，一方面，在未被脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 激活的巨噬细胞中，EPS103可显著增强细胞的吞噬能力，并促进促炎细胞分子（IL-6、TNF-α 和NO）的分泌；另一方面，在LPS 激活的巨噬细胞中，EPS103 能显著抑制促炎细胞分子产生以及相关基因的表达，缓解LPS 对细胞产生的刺激，说明EPS 既可以适当促进炎症反应，加快机体修复，也可以抑制促炎分子分泌，防止过度免疫。

2.4 抑菌活性

滥用抗生素带来的耐药性细菌日益增多已成为一个世界性的问题，除了对抗生素的使用进行更科学的管理外，还迫切需要开发更加绿色高效的抗生素替代品[43]。多糖的抑菌机制主要有抑制细菌生物膜的形成、阻碍细菌代谢、破坏细菌细胞壁和细胞膜、降低基因转录水平等[44]。

唐少军等[45]对粗毛纤孔菌EPS 抑菌能力进行了探究，结果发现该EPS 对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌均有明显的抑制作用，抑菌圈直径分别为12、11、11 mm。淡水微藻的EPS 对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径可以达到14.72 mm，表现出较强的抑菌能力[46]。Xu 等[47]研究发现，干酪乳杆菌EPS 对金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O157∶H7 均有抑制作用，该EPS 可通过抑制生物膜的形成和分散病原菌发挥抗菌性能。Hu 等[15]发现，乳杆菌PW-7 EPS 具有抑菌作用且对幽门螺杆菌的最低抑制浓度为50 mg/mL，抗菌机理研究结果表明该EPS通过破坏幽门螺杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜发挥其抗菌作用。

2.5 其他活性

微生物胞外多糖除上述活性外，还具有乳化、保湿、金属离子吸附等活性。杨艳芳[48]对柠檬明串珠菌N21 的EPS 进行乳化试验，结果显示，7 d 与24 d 时该EPS 对葵花油的乳化指数与24 h 的乳化指数无显著差异，表明其具有良好的乳化稳定性，可作为食品添加剂提高食品的乳化稳定性。曹永强等[49]研究两株植物乳杆菌EPS 的乳化特性，结果表明二者均可形成相对较小的乳化颗粒，且两者的胞外多糖均对十六烷有极强的乳化效果，24 h 内最高可达（93.01±2.29）%和（83.33±1.21）%。周璇[50]对地衣芽孢杆菌Ⅱ4-01 胞外多糖在不同环境中的吸湿活性和保湿活性进行了探究，结果显示在相对湿度为43%和81%环境中，纯多糖的吸湿能力强于壳聚糖和黄原胶；在相对湿度0%（干燥硅胶）环境中，多糖的保湿活性明显高于壳聚糖和黄原胶。关志国等[51]在研究中采用红球菌HX-2 产生的EPS 吸附水体中的Cu2＋，经模型拟合得到最大吸附量，为144.93 mg/g，这一特性可应用于工业废水中重金属离子的治理。

EPS 因具有特殊的理化性质，在食品中添加EPS成为一种功能性食品开发的研究方向。赖田甜等[52]在植物乳杆菌NMGL2 对鲜牛乳发酵过程中添加胞外多糖，结果表明其能显著提高发酵乳的弹性和黏性，显著降低流动性和硬度。张逢温等[53]研究发现，融合魏斯氏菌胞外多糖对无蛋蛋糕面糊特性和烘焙品质具有显著的改善作用。Yuan 等[54]将强雄腐霉胞外多糖PEPS-2 应用于草莓保鲜中，结果显示该多糖可显著提高草莓采后的生理品质，有效延缓草莓腐烂、延长草莓货架期。总之，EPS 具备的优良特性可使其作为天然食品添加剂，如抗氧化剂、稳定剂、增稠剂等应用在食品行业中。

3 胞外多糖结构与活性的构效关系

微生物EPS 的生物活性与结构息息相关，多糖的结构影响其物理性质，从而对生物活性产生影响。明晰多糖结构与活性之间的构效关系有利于功能性多糖的特异性筛选和应用。由于多糖结构复杂，解析难度大，目前对结构与活性的构效关系研究还不够深入，但根据目前的研究探索可知多糖的单糖组成、分子量、糖苷键、分子构象、取代基等对多糖功能均具有不同程度的影响。

单糖是EPS 最基础的组成单元，与EPS 的活性紧密相关。Zhu 等[55]从菌株SJ14 中分离得到的两种富含甘露糖的胞外多糖EPS-1（75.9%）和EPS-3（28.7%）均表现出较好的自由基清除活性，且EPS-1 的清除活性显著高于EPS-3，表明EPS 中含有甘露糖可能使其具有较强的抗氧化活性。Lo 等[56]以香菇多糖为样品探究了抗氧化性与单糖组成之间的关系，结果表明，随着鼠李糖和甘露糖含量的增加，抗氧化性能也随之增大。EPS 分子量的大小对生物活性的发挥具有重要影响，与较大的EPS 相比，低分子量EPS 中存在更多的游离还原羟基末端，而且更容易穿透细胞，可通过羟基提供电子或氢发挥自由基清除能力，保护细胞免受自由基损伤[11]，在提高其抗氧化活性方面起着至关重要的作用[57]。而较大分子量的EPS 与抗肿瘤活性相关，不同种类的多糖发挥抗肿瘤活性的分子量分段不同，通常情况下，在一定浓度范围内，分子量越高的多糖水溶性越高，抗肿瘤活性也越强[58]。EPS 的糖苷键对其生物活性同样具有重要的影响，目前尚未有确切定论，但在当前研究中发现了一些规律，如α-（1→6）-糖苷键对EPS 清除反应具有积极作用，因为这种键可以提供灵活的区域，增加活性基团与自由基相互作用的可及性[11]。一些以β-（1→2）连接的葡聚糖、半乳糖和甘露糖，大多具有抗肿瘤活性，以β-（1→6）连接的葡聚糖不具有抗肿瘤活性[59]。除此之外，EPS 的生物活性与三螺旋结构也关联密切，尤其是免疫调节和抗癌作用方面[60]。Kojima 等[61]研究发现，如果三螺旋结构消失，发生解旋，会极大降低多糖的活性，造成多糖的抗肿瘤活性消失。Zhang 等[62]研究发现，不同种香菇多糖在分子质量相近的情况下，具有三螺旋结构的香菇多糖对肉瘤S-180 细胞的抑制率高于不具有三螺旋结构的香菇多糖。

4 结论与展望

微生物胞外多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎、乳化等多种生物活性，且毒副作用小，可成为化学合成聚合物的替代品，在食品、药品、化妆品等行业具有较大的应用潜力，成为近年来的研究热点之一。微生物胞外多糖的这些活性与其单糖组成、分子量、糖苷键等结构密切相关。目前关于胞外多糖的活性研究较多，但结构复杂，解析困难，未能深入挖掘生物活性与结构的构效关系。除此之外，有关胞外多糖的研究大多数为实验室规模，无法满足大规模生产，胞外多糖的放大应用研究仍需突破。