一株鹌鹑大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

赵洪杰

（山东省肥城市潮泉镇畜牧兽医站，山东 肥城 271614）

禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的禽多病型的总称，严重者可导致病禽的死亡[1]。其中鹌鹑大肠杆菌病的发生无明显的季节性，各日龄均可感染，饲养条件不良、饲养管理不善和应激反应等均可导致鹌鹑免疫力的下降，引发鹌鹑发病[2]，临床表现为食欲不振、机体消瘦、羽毛蓬松、产蛋量下降，主要病理变化为多器官组织的实质性损伤并伴有气囊炎、心包炎、卵泡液化和卵黄性腹膜炎等症状。鹌鹑的大肠杆菌病感染率高，给鹌鹑养殖业带来了严重的经济损失[3]。目前治疗该病的主要手段为使用抗菌药物，但随着抗生素在养殖生产中的广泛应用，致病性大肠杆菌对常用抗生素的耐药性日益增强，多重耐药性菌株不断增多，为该病的防控和治疗带来困难[4]。因此，对分离菌株进行药物敏感性分析，可为该病的药物防治提供借鉴与参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例来源 山东省一鹌鹑养殖场发病死亡的42日龄产蛋鹌鹑。

1.1.2 主要仪器与试剂 MALDI-TOF质谱仪（德国BRUKER）；麦康凯琼脂培养基、LB琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司；革兰染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；细菌药敏试纸购自杭州滨和微生物有限公司；超净工作台购自苏州净化设备有限公司。

图1 剖检病理变化A. 口腔有黏液；B. 气管环出血；C. 心包炎；D. 肠黏膜脱落；E. 心包积液；F. 心脏干酪样坏死。

图2 细菌的分离鉴定及镜检结果A. 麦康凯培养基上培养形态；B. 可疑菌镜检图片（1000 X）。

图3 疑似菌落的质谱测定

1.2 方法

1.2.1 病理剖检观察 对病死鹌鹑进行病理剖检，观察各脏器的病理变化。

1.2.2 病原学检测 （1）细菌的分离培养。于超净台内无菌采集病死鹌鹑的肝脏，用灭菌接种环进行取样，分别划线接种于麦康凯琼脂培养基，于37 ℃ 恒温培养箱中倒置培养12 h。（2）革兰染色。挑取上述（1）步骤中培养基所长菌落进行革兰染色，具体操作步骤参照北京索莱宝科技有限公司革兰染色试剂盒说明书进行，染色后于显微镜下观察细菌染色情况及形态特征。

1.2.3 质谱测定 挑取麦康凯培养基上的单菌落，利用MALDI-TOF细菌质谱仪进行质谱测定。

1.2.4 药敏试验 将分离到的菌落扩大培养，然后稀释均匀涂布于LB琼脂培养基，最后将药敏试纸有序贴至培养基上，于37 ℃ 恒温培养箱中倒置培养12 h，观察抑菌效果。

2 结果

2.1 剖检结果

剖检可见病死鹌鹑机体干瘪呈脱水状，口腔嗉囊有黏液分泌，气管环浑浊出血，肠道壁变薄，肠黏膜脱落，内容物呈黄褐色，弥漫性条带状出血。卵泡液化变性，卵黄性腹膜炎，肝脏充血坏死，心脏、肝脏有纤维渗出、干酪样分泌物。具体病变见图1。

2.2 细菌的分离鉴定及镜检结果

将病料用接种环接种于麦康凯培养基上，可见粉红色的菌落（图2 A）。革兰染色后于显微镜下观察，见红色短小杆状菌（图2 B），初步判断为大肠杆菌。

2.3 细菌质谱检测

质谱测定结果显示，麦康凯培养基上的红色菌落为大肠杆菌。

2.4 药敏结果

药物敏感性试验见图4，可见1、2、5、6、9、12号药物周围具有抑菌圈，结果统计如表1所示，分离到的大肠杆菌对阿米卡星敏感，对庆大霉素、头孢他啶、氨苄西林、头孢噻吩、链霉素、头孢噻肟、头孢唑林、头孢哌酮、氧氟沙星、卡那霉素和妥布霉素耐药。

表1 药敏试验结果

图4 大肠杆菌分离株的药物敏感性试验结果

3 讨论

鹌鹑是家禽中体型较小的品种，在国内外家禽养殖业中占据重要地位，具有较高的经济价值[5]。鹌鹑大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌引起的鹌鹑常见病，各日龄鹌鹑均易感染发病，感染鹌鹑常表现为精神萎顿、羽松翅垂、闭眼昏睡、站立不稳、食欲不振或废绝、饮水增加、腹泻下痢甚至死亡，同时对产蛋率及蛋的品质影响很大，给鹌鹑养殖带来巨大的经济损失。大肠杆菌在环境中常在，且绝大多数大肠杆菌不会影响动物的健康，但当机体因各种原因出现免疫力下降和应激等情况下，大肠杆菌就会成为影响动物健康的“罪魁祸首”。在经询问病史、临床症状观察及剖检检查后，初步确定发病原因为大肠杆菌感染。因此，采集病死鸡肝脏进行细菌的病原学检测，分离物在特定培养基上的菌落特点及革兰染色结果符合大肠杆菌的特征。常规的细菌鉴定方法可通过生化试验来确证，为实现疾病的及时诊断，采用微生物MALDI-TOF质谱仪进行了细菌的快速鉴定。微生物MALDI-TOF质谱仪检测方法具有操作简单、快速、通量高、灵敏度高、准确度好的优点[6]，在本次诊断中，将质谱仪检测运用到大肠杆菌的鉴定中，快速获得了阳性结果，为疾病的控制赢得了时间。通过剖检变化、细菌分离鉴定，特别是质谱快速测定，该鹌鹑场产蛋鹌鹑大量死亡的原因可判定为致病性大肠杆菌的感染导致。建议饲养场加强饲养管理，保持笼舍干燥通风，定期进行消毒，同时减少对动物的应激。

目前治疗鹌鹑大肠杆菌病的常用方法为使用抗生素，但随着抗生素在鹌鹑养殖中的广泛应用，大肠杆菌对常用抗生素的耐药性日益增强，本试验对分离到的大肠杆菌做了药物敏感性测定。结果显示分离株只对阿米卡星敏感，对其他11种抗生素均耐药，因此建议该饲养场可选择阿米卡星进行治疗。

4 结论

本文利用临床诊断、细菌分离鉴定，特别是质谱快速测定方法，对发病产蛋鹌鹑的病原做了快速检测，并分析了大肠杆菌分离菌株的药物敏感性，为鹌鹑大肠杆菌病的及时防治提供了借鉴与参考。