双孢蘑菇凝集素对兔耳创面愈合增生性瘢痕的作用研究*

林平发，林勇，林婷婷

（福建卫生职业技术学院，福建 福州 350101）

瘢痕是创伤修复的必然结果，增生性瘢痕（Hypertrophic scars,HS）是手术后、烧伤、创伤等常见的病理性修复的异常结果。成纤维细胞的异常增殖，胶原在细胞外基质组织中过度沉积，而降解不足是导致增生性瘢痕形成的原因[1]。增生性瘫痕是整形外科常见疾病，在我国有比较高的发病率，目前对其防治仍是现代医学的难题之一，因此寻找预防和治疗瘢痕增生的药物具有重要的意义。本研究建立兔耳增生性瘢痕模型，来观察双孢蘑菇凝集素对增生性瘢痕的影响，为增生性瘢痕的治疗药物的临床开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

成年雄性新西兰大白兔12只，体重（2±0.5）kg，由上海市松江区松联实验动物场提供[许可证号码：SCXK（沪）2017-0008]，双孢蘑菇凝集素购自Cosmo Bio Co.Ltd（批号lot.32508A）。大白兔在实验全过程中均采取单笼喂养，自由饮水摄食。

1.2 实验方法

1.2.1 瘢痕模型制作

大白兔适应性饲养7 d后，采取耳缘静脉麻醉，避开可见血管用手术刀去除兔耳腹面皮肤及软骨膜，制作1 cm×1 cm大小的圆形创面，创面间隔2.5 cm以上，每耳4处创面，共96个创面，创面暴露不做包扎，待其自行愈合形成瘢痕[2]。在术后30 d左右创面周围隆起形成增生性瘢痕，随机取样，经病理切片证实为增生性瘢痕组织。

1.2.2 分组给药

将兔随机分为4组，每组3只（共24个瘢痕），分别为：空白组（生理盐水组），高（400 mg /L）、中（200 mg /L）、低（100 mg /L）剂量双孢蘑菇凝集素组。用微量注射器从创面周围的正常皮肤进针向创面基底部及创面灶内行局部注射，隔日1次，每个瘢痕组织注射20μL至皮肤苍白并稍微隆。28 d后处死动物，切取瘢痕标本组织。

1.3 指标观察

观察瘢痕组织外观大体形态变化，测量28 d的兔耳瘢痕厚度及瘢痕增生指数（Hypertrophic Index,HI）。用微尺测量相对增生厚度，设定瘢痕的高度（Scar height）为SH，正常皮肤高度（dermis height）为DH，则HI=SH/DH，计算对比各组瘢痕增生指数（HI）[3]。HE染色观察28 d瘢痕组织成纤维细胞变化情况，于光镜下观察PCNA及CD34的蛋白表达情况。随机选取5个高倍视野进行PCNA阳性细胞计数，PCNA阳性细胞表达率%=阳性细胞数/细胞总数×100%，结果取平均数。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件处理。计量数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，其中p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘢痕外观形态观察

造模30 d后兔耳腹部形成明显的不同程度凸起斑块，高于周围正常皮肤，色淡红，质硬。在治疗28 d后，治疗组的瘢痕变软，色素变淡，硬块明显变小，瘢痕厚度低于空白组。

2.2 瘢痕厚度及瘢痕增生指数测定

测定治疗后28 d瘢痕厚度，计算瘢痕增生指数（HI）。可见随着剂量的增加，瘢痕厚度逐渐降低。结果见表1。

表1 治疗28 d瘢痕厚度及瘢痕增生指数、PCNA阳性表达率（±s,mm,n=24）

表1 治疗28 d瘢痕厚度及瘢痕增生指数、PCNA阳性表达率（±s,mm,n=24）

注：“*”与生理盐水组比较，P＜0.05。

组别空白组低剂量组中剂量组高剂量组厚度（mm）3.83±0.75 3.39±0.65 2.87±0.69*2.26±0.63*增生指数（HI）3.48±0.68 3.08±0.60 2.61±0.63*2.06±0.57*PCNA阳性表达率65.2±9.1 58.3±6.7 49.5±5.1*37.2±5.1*

2.3 瘢痕组织HE染色切结果观察

在光镜下可观察到，空白组鳞状上皮下瘢痕组织明显增厚，大量梭形成纤维细胞增生，密集排列，局部伴玻璃样变性，其间多见慢性炎症细胞浸润，周围毛细血管增生明显（图1）。在治疗28 d后，随着药物剂量的增加，瘢痕组织鳞状上皮下成纤维细胞排列较疏松，增生密度降低，炎症细胞及毛细血管数量减少，玻璃样变性更明显（图2、图3、图4）。

图1 空白组

图2 低剂量组

图3 中剂量组

图4 高剂量组（均质红染无结构状物明显增多）

2.4 瘢痕组织免疫组化染色结果观察

2.4.1 PCNA表达情况

PCNA 阳性定位于成纤维细胞核，呈棕色颗粒状，免疫组化染色结果可见PCNA表达与双孢蘑菇凝集素剂量负相关，高剂量组的PCNA表达明显下降。结果见图5、图6、图7、图8。PCNA阳性细胞表达率结果见表1。

图5 空白组

图6 低剂量

图7 中剂量

图8 高剂量

2.4.2 CD34表达情况

CD34 阳性定位于血管内皮细胞浆/膜，可清晰显示毛细血管腔环形结构，随着双孢蘑菇凝集素剂量的增加CD34表达明显下降。治疗28 d后免疫组化染色结果见图9、图10、图11、图12。

图9 空白组

图10 低剂量

图11 中剂量

图12 高剂量

3 讨论

机体受到创伤、烧伤等会导致皮肤纤维结缔组织过度修复从而导致增生性瘢痕的形成，同时多种细胞因子如生长因子（TGF-β）和各种细胞通路等也会促进瘢痕增生[4]。增生性瘢痕会导致患者出现如疼痛、瘙痒等症状，还会形成色素沉着，影响美观和功能，甚至给患者带来心理负担。因此对于创伤等导致的增生性瘢痕的治疗显得意义重大。目前对瘢痕的治疗方法比较多，一般包括药物治疗、手术切除、物理治疗等[5]，但效果差强人意，因此需要寻找新的药物来更好地治疗增生性瘢痕。

双孢蘑菇，学名Agaricus bisporus，在分类上隶属真菌门，担子菌纲，无隔担子菌亚纲，伞菌目，蘑菇科，蘑菇属。凝集素是一类非免疫起源的蛋白或糖蛋白，具有糖专一性结合位点，广泛存在于各种动物、植物、真菌、细菌以及病毒中，由于其中不少种类具有抗病原菌、杀灭昆虫、调节内环境、抗肿瘤等功能使得凝集素逐渐成为国内外研究热点之一[6]。目前双孢蘑菇凝集素抑制细胞增殖这一研究较少，过度的细胞增殖是增生性瘢痕的直观特点，而双孢蘑菇凝集素的细胞增殖抑制活性使得双孢蘑菇凝集素在增生性瘢痕治疗方面或许具有潜在的治疗价值[7]。

本实验通过构建兔耳增生性瘢痕模型，在兔耳腹形成瘢痕后，给予局部注射双孢蘑菇凝集素进行干预，观察其对瘢痕组织的影响。发现在干预28d后实验组瘢痕厚度变低、质地变软，治疗组瘢痕组织厚度及瘢痕增生指数（HI）低于对照组（P＜0.05）。实验组的HE染色结果显示，随着药物剂量的增加，瘢痕组织中成纤维细胞增生密度降低，排列较规整，炎症细胞及毛细血管数量减少，说明随着浓度增加，双孢蘑菇凝集素可抑制瘢痕组织细胞增殖。实验组的PCNA及CD34蛋白表达明显下降，呈剂量负相关，并且PCNA蛋白阳性表达率低于空白组（P＜0.05），表明双孢蘑菇凝集素抑制瘢痕组织纤维细胞的异常增殖，可能与减少瘢痕组织细胞PCNA及CD34蛋白的表达有关。本实验开展双孢蘑菇凝集素对瘢痕增生防治作用的研究，对于研发减轻或消除瘢痕造成的各种畸形的治疗药物以及进一步开发利用双孢蘑菇资源提供理论依据。