不同倍性蓝靛果叶片活性成分含量分析

盛煜钧

摘   要   以二倍体、四倍体、八倍体蓝靛果组培苗及大田苗为试材，采用分光光度法测定并分析了蓝靛果叶片生理活性成分含量差异，为多倍体蓝靛果植株的早期筛选提供了依据。结果表明：蓝靛果叶片中花青素、类黄酮和总酚含量随倍性升高而升高，八倍体含量显著高于二倍体和四倍体，四倍体明显高于二倍体，组培苗和大田苗趋势一致。Vc含量随倍性增加逐渐减少，二倍体和八倍体有明显差异，二倍体和四倍体有差异但不明显。随倍性增加，叶片中叶绿素含量升高，且不同倍性总叶绿素含量存在显著差异。不同倍性蓝靛果叶片的叶色值存在显著差异，倍性越大，叶色值越大，绿色越浓郁，组培苗和大田苗趋势一致。蓝靛果叶片氮素含量与倍性呈正相关，组培苗和大田苗趋势一致。

关键词   多倍体；蓝靛果；花青素；叶绿素；维生素C

蓝靛果是忍冬科忍冬属多年生落叶小灌木浆果植物，又称山茄子、羊奶子、黑瞎子果等。其果实口感酸甜微涩，具有丰富的活性物质，可作为酿酒原料、饮料制作原料、天然色素原料。花期5—6月，果熟期8—9月。蓝靛果中含有10%～17%的干物质（糖5%～10%，酸1.5%～4.5%），含有18种氨基酸，含量比多数常见水果高，还含有铁、锰、镁、钙、钾、钠、磷、锌等矿质元素和5种维生素（维生素C、B1、B2、B6和维生素P），具有较高的药用和保健功能。前人多项研究表明，蓝靛果具有抗氧化、改善心肌氧供求、治疗冠心病、降低体重、降血脂、抗疲劳、保护肝组织等功效，还能加工制成果酒、果酱、果汁等，也可作为园林绿化和观赏树种。

目前我国的蓝靛果多倍体研究主要采用秋水仙素诱导方式或倍体诱导方式获得，我们对蓝靛果叶片活性成分含量进行测定分析，以期为早期筛选符合条件的多倍体、研究应用多倍体蓝靛果活性成分提供参考。

1   材料与方法

1.1   试验材料   长白山野生蓝靛果中筛选出的优良单株二倍体及其人工诱导的四倍体、八倍体蓝靛果组培苗及1年生大田苗。

组培苗：采用继代培养35天的组培苗1～2片顶叶；大田苗：采用7月中旬1年生大田苗充分展开的顶叶1～2片。

试剂：丙醇、无水乙醇、盐酸、乙醇、钼酸铵、草酸、乙二胺四乙酸二钠、磷酸、冰乙酸、抗坏血酸、硫酸。

1.2   试验仪器及设备   分光光度计；冰箱；恒温水浴锅；离心机；研钵；试管；具塞三角瓶

1.3   试验方法

1.3.1   花青素、总酚、类黄酮含量的测定   准确称取0.2 g叶片，剪成0.1 cm条状，加入20  mL盐酸（1.5 mmol/L）和95%乙醇（體积比15 ∶ 85）的混合液，置于暗处浸泡24小时，提取叶片中的花青素，按照王庆菊等的测定方法，按照以下公式可计算单位质量叶片中花青素、类黄酮和总酚的含量。

式中：

A：测定的吸光值

V：提取液体积（mL）

W：样品重（g）

1.3.2   Vc含量的测定   参考植物生理学实验指导的试验方法测定Vc含量。

1）溶液配制。①5%的钼酸铵溶液：5 g钼酸铵定容至100 mL；②草酸-EDTA溶液：分别称取草酸4.502 g、EDTA-Na2 0.75 g溶于蒸馏水，混合定容至1 L；③硫酸：按照1 ∶ 19比例配置所需的量；④偏磷酸-乙酸溶液：取片状或新粉碎的棒状片磷酸3 g，加1 ∶ 5冰乙酸40  mL溶解后，加水定容至100 mL，此试剂在冰箱中可保存3天，现用现配效果最佳；⑤1 mg/mL标准维生素C溶液：精确称取抗坏血酸100 mg，适量草酸-EDTA溶液溶解，定容至100 mL摇匀备用，标准品溶液需现用现配。

2）标准曲线的制备。吸取标准维生素C溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL，于具塞刻度试管中，加入溶液②定容至5 mL后，依次加入0.5 mL溶液④，1 mL溶液③，摇匀后再加2 mL溶液①，加水稀释定容至15 mL，摇匀。于30 ℃水浴中放置15分钟。以未加标准维生素C试管调零，在760 nm波长处测光 密度。

3）样品中维生素C含量的测定。精确称取样品1 g置于研钵中，加少量溶液②，研磨至匀浆，放入锥形瓶中，加溶液②定容至10 mL，振荡30分钟，放置30分钟。倒入离心管中配平后，以4 000 rpm/分钟离心15分钟。取上清液1 mL于刻度试管中，加溶液②定容至5 mL，依次加入0.5 mL溶液④，1 mL溶液③，摇匀后再加2 mL溶液①，加水稀释定容至15 mL，摇匀。于30 ℃水浴中放置15分钟，上清液即为待测样液，于760 nm波长处测光密度。

4）结果计算。根据标准曲线求出维生素C毫克数，然后按下式计算样品中的维生素C含量：

维生素C含量（mg/g）=（C×Vt）/（W×Vm）

式中：

C：测定液中维生素C毫克数（mg）

Vt：提取液总体积（mL）

Vm：测定液体积（mL）

W：样品重（g）

1.3.3   叶绿素含量的测定   精确称取0.1 g叶片，加入10 mL丙酮和无水乙醇（体积比1 ∶ 2）的混合溶液，室温避光浸提24小时，将提取溶液过滤并置于光径为1 cm的比色皿中，以丙酮与无水乙醇混合溶剂作对照，用可见分 光光度计中测定吸光度，再根据提取溶液在645 nm和663 nm处的吸光度，由Amon公  式算叶绿素a（Ca）、叶绿素b（Cb）和总叶绿素    含量。

式中：

Ca、Cb：叶绿素a、b含量（mg/g）

A663、A645：663 nm、645 nm测定的吸光值

V：测定液体积（mL）

W：样品重（g）

1.3.4   叶片氮素及叶色值的测定   利用植株养分速测仪（TYS-3N）对蓝靛果叶片中氮素含量及叶色值进行测定，测定的叶片采用正常生长且没有虫食的健康叶片，每个株系测定20个叶片，对每个叶片不同位置测10次，最后结果取平均值。

2   结果与分析

2.1   蓝靛果倍性与花青素、总酚、类黄酮含量、维生素C的关系

由表1可知，二倍体、四倍体、八倍体大田苗与组培苗叶片中花青素、类黄酮、总酚含量3个指标不同倍性间差异显著；大田苗叶片中维生素C的含量是随着倍性增加逐渐降低，二倍体和四倍体显著高于八倍体，二倍体和四倍体之间没有显著差异；组培苗中同样是随着倍性增加下降的趋势，二倍体显著高于八倍体，二倍体和四倍体、四倍体和八倍体之间均有差异但不显著。

2.2   蓝靛果倍性与叶绿素的关系

由表2可知，八倍体的Ca和Cb的含量与二倍体之间存在显著差异，四倍体和二倍体与四倍体和八倍体均是有差异但不显著；不同倍性蓝靛果大田苗总叶绿素含量存在显著差异，八倍体显著高于四倍体和二倍体，四倍体显著高于二倍体；蓝靛果大田苗三种倍性叶片中的总叶绿素均高于相对应倍性组培苗中的含量；叶绿素a和叶绿素b比值随着倍性升高而降低，八倍体和四倍体、四倍体和二倍体均存在差异，但差异不显著。以上四个指标组培苗与大田苗变化趋势一致。

2.3   蓝靛果倍性与叶色值和氮素的关系

由表3可知，三种倍性蓝靛大田苗果叶色值随倍性升高而升高，不同倍性间差异显著，组培苗和大田苗变化趋势一致；八倍体大田苗氮素顯著高于二倍体，大田苗氮素含量四倍体和八倍体、四倍体和二倍体之间均有差异但不显著，组培苗氮素含量与大田苗变化趋势    一致。

3   结论

采用不同倍性蓝靛果组培苗和大田苗叶片为试验材料，探讨不同倍性蓝靛果组培苗和大田苗叶片活性成分含量，着重对叶绿素、花青素、总酚、类黄酮、维生素C进行分析，为早   期预测品种是否符合多倍体特征提供了参考 依据。

前人研究表明，蓝靛果不同组织部位活性成分含量有所不同。因此，可以在接下来的试验中对不同倍性蓝靛果的果实进行活性成分测定，通过数据的对比分析了解活性成分含量的分布以及随倍性改变果实活性含量变化，以便为后续研究利用提供参考。

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