基于网络药理学探究青蒿抗弓形虫病的作用机制

萧 晟, 熊 冉

(芜湖职业技术学院,安徽 芜湖 241003)

弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)感染人和多种动物所引起的一种共患性传染病[1-2]。弓形虫经口感染后在肠道部位侵入黏膜上皮,通过循环系统播散全身致病,严重危害人畜的健康[3]。青蒿具有清热、截疟、退黄之功效,研究表明其可以有效治疗弓形虫[4]、疟原虫[5]、日本血吸虫[6]等寄生虫的感染,但是其治疗分子机制目前仍不明确。随着高通量组学技术的发展,以及计算机技术的介入,在生物信息学技术背景下提出网络药理学说,该学说是以网络靶标方法将中药、病证映射于生物分子网络,以网络为基础建立中药与病证的关联机制[7]。目前,利用网络药理学技术在系统性红斑狼疮[8]、脑型疟[9]、新型冠状病毒肺炎[10]等方面取得了突出的进展,奠定了青蒿治疗疾病的成分-靶点基础,但其用于治疗弓形虫病的研究较少。因此,为了明确青蒿抗弓形虫病的成分-靶点基础,揭示青蒿抗弓形虫病的内在机制,本研究采用网络药理学的方法获取青蒿抗弓形虫病的成分-靶点信息,经富集获取弓形虫病特异性靶点,并使用小鼠弓形虫感染模型进行验证,揭示青蒿抗弓形虫病的内在机制,为青蒿治疗弓形虫病提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

30只体质量(18±2) g SPF级ICR雌性小鼠(SCXK(皖)2017-001)购自安徽医科大学实验动物中心;TRIzol RNA(Thermo Fisher Scientific);High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific);PowerTrackTMSYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)。青蒿采自安徽省芜湖职业技术学院,榨汁机榨汁,3 000 r/min离心15 min,取上清液40 ℃下浓缩至生药质量浓度为1 mg/mL,备用。

1.2 TCMSP网络药理学分析

本研究从TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)获取20种代表性的青蒿成分(OB≥30%,DL≥0.18),使用Pub Chem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取青蒿成分的SMILES文件,在Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch)中构建青蒿活性成分的化学结构并预测靶点;在Gene cards(www.genecards.org)获取弓形虫感染靶点。使用Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在线工具获取青蒿和弓形虫感染共表达靶点(cDEGs),使用String(https://string-db.org/)进行cDEGs蛋白互作分析并使用Cytoscape 3.7.0构建PPI蛋白互作网络图,并使用MCODE对PPI蛋白互作网络图上的cDEGs进行筛选获得高相关性靶点(hug DEGs)。使用hug DEGs对青蒿靶点进行筛选,获得hug DEGs相对应的青蒿活性成分,并构建network和type文档导入Cytoscape 3.7.0构建成分-靶点可视化网络图。使用David网站(https://david.ncifcrf.gov/)中GO和KEGG分析hug DEGs,进行功能富集,获得弓形虫病特异性靶点。

1.3 动物试验靶点验证

2 结果与分析

2.1 青蒿活性成分和弓形虫感染共表达靶点筛选

从TCMSP中获取20种代表性的青蒿成分,经过Swiss Target Prediction预测获得519个青蒿成分的靶点信息;在Gene cards中查询弓形虫感染的靶点346个,Draw Venn Diagram在线工具对青蒿成分的靶点和弓形虫感染进行交集分析,共获得47个cDEGs(图1)。

图1 青蒿成分和弓形虫感染靶点Venn图Fig.1 The Venn of Artemisia apiaceaingredients and cough expression target

2.2 PPI蛋白互作网络图的构建

如图2所示,使用String数据库对cDEGs分析并获得TSV文件,导入Cytoscape 3.7.0构建PPI蛋白互作网络图,该网络图包含46 nodes和550 edges;使用MCODE对PPI蛋白互作网络图上的cDEGs进行筛选获得19 hug DEGs(19 nodes和282 edges)。

图2 PPI蛋白互作网络图Fig.2 PPI protein interaction network targets

2.3 靶点-成分网络图构建

使用hug DEGs对青蒿靶点进行筛选,获得19个与hug DEGs相对应的青蒿成分-靶点信息,利用Cytoscape 3.7.0软件将筛选出的19 hug DEGs与19种青蒿成分的靶点构建靶点-成分可视化网络图,网络图中38 nodes和131 edges直观反应成分和靶点之间的相互作用。通过比较Degree值的大小(Degree≥7),推测出青蒿成分中的青蒿黄素、青蒿素、脱氧青蒿素、双氢青蒿素、线蓟素、甲氧基寿菊素、泽兰黄醇素、异鼠李素、山奈酚、万寿菊素、槲皮素、柽柳黄素等与青蒿抗弓形虫感染靶点密切相关(图3)。

图3 靶点-成分网络图Fig.3 The targets-ingredients network

2.4 功能富集分析

使用David网站对hug DEGs进行筛选富集分析,GO富集结果显示,生物过程(BP)主要富集在细胞对活性氧的反应、正调控凋亡过程、蛋白质磷酸化、正调控细胞增殖、MAPK级联途径等,细胞组分主要富集在细胞核、细胞膜结构、线粒体、细胞表面等,分子功能(MF)主要富集在蛋白激酶活性、蛋白结合、泛素蛋白连接酶结合等方面(图4A)。KEGG富集结果显示,PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、趋化因子信号通路、弓形虫病等方面(图4B),其中,与弓形虫病相关靶点有AKT1、MAPK1、MAPK14、MAPK3、NOS2、STAT1、TNF,涉及MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、Jak/STAT信号通路等(图5)。

图4 GO(A)和KEGG(B)富集分析结果Fig.4 Results of GO(A)and KEGG(B) enrichment analysis

图5 弓形虫病信号通路图Fig.5 Toxoplasmosis signaling pathway

2.5 动物试验靶点验证

动物试验表明,模型组小鼠弓形虫感染死亡率要高于空白组,与模型组相比,青蒿能显著提高小鼠的生存率(图6)。选取与弓形虫病相关靶点AKT1、MAPK14、NOS2、STAT1、TNF-α等进行qRT-PCR验证,结果如图7所示,弓形虫感染能够显著上调AKT1、MAPK14、NOS2、STAT1、TNF-αmRNA的表达(P<0.05),使用青蒿干预治疗后,AKT1、MAPK14、NOS2、STAT1、TNF-αmRNA显著下调(P<0.05)。

图6 弓形虫感染生存率变化Fig.6 The percent survival of toxoplasmosis

图7 弓形虫感染小鼠肝脏相关基因表达结果Fig.7 Relative liver gene expression in toxoplasmosis induced mice

3 结论与讨论

青蒿是我国传统的抗寄生虫中药,其有效成分青蒿素、双氢青蒿素具有显著的抗疟疾作用,并被作为指定用于临床的抗疟药物[12]。研究表明,青蒿及其提取物对刚地弓形虫、利什曼原虫、冈比锥虫和枯氏锥虫均有不同程度抑制作用[13]。尹卫东等[14]研究发现,双氢青蒿素可以有效治疗小鼠弓形虫速殖子感染,并可使弓形虫速殖子细胞膜结构发生损伤。本研究通过网络药理学构建靶点-成分可视化网络图发现,青蒿的抗弓形虫感染可能与青蒿素、双氢青蒿素、青蒿黄素、脱氧青蒿素、线蓟素、甲氧基寿菊素、泽兰黄醇素、异鼠李素、山奈酚、万寿菊素、槲皮素、柽柳黄素密切相关。

王盼[15]研究表明,青蒿素抗按蚊传疟能力与Toll信号通路有关,其通过活化关键分子MyD88和Rel 1发挥抗疟作用。周永华等[16]研究表明,青蒿琥酯可以通过下调HSP47的表达水平抑制胶原合成,进而减轻日本血吸虫诱导的早期肝纤维化。但是该研究没有揭示青蒿抗弓形虫感染机制,本研究通过KEGG富集分析发现,青蒿抗弓形虫感染机制可能与MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、Jak/STAT信号通路等有关,涉及AKT1、MAPK1、MAPK14、MAPK3、NOS2、STAT1、TNF等靶点。同时通过小鼠弓形虫感染验证,弓形虫感染能够显著上调AKT1、MAPK14、NOS2、STAT1、TNF-αmRNA的表达,使用青蒿进行干预治疗后,生存率显著升高,AKT1、MAPK14、NOS2、STAT1、TNF-αmRNA显著下调。表明这些基因在青蒿治疗弓形虫感染过程中发挥关键作用。

综上,青蒿治疗弓形虫感染的机制可能与AKT1、MAPK14、NOS2、STAT1、TNF-α等靶点密切相关,可能涉及MAPK信号通路、Toll样受体信号通路以及Jak/STAT信号通路。