5个品种草莓茎尖组培快繁体系的建立

毛 敏, 彭安妹, 徐梦琴, 何克勤, 胡能兵, 崔广荣

(安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100)

草莓(FragariaⅹananassaDuch.)为蔷薇科(Rosaceae)、草莓属(Fragaria)、多年生的草本植物[1],是一种非常重要的经济作物[2]。草莓栽培具有短周期、容易管理、强适应性等特点,在促进农民增产增收中发挥着重要作用[3-4]。如今中国在草莓总产量和栽培面积方面,已居于世界前列[5]。

草莓的繁殖方式主要是无性繁殖,匍匐茎繁殖是其最常见的繁殖方式。草莓栽培生产中常见问题是易受病毒侵染,侵染草莓的病毒主要有草莓斑驳病毒、草莓镶脉病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓皱缩病毒和草莓潜隐环斑病毒[6]。感染病毒的植株易造成复合感染,导致草莓植株生长速度变慢、叶片不能正常展开、果实逐渐变小、果实的品质变差等,一般能使草莓的产量减少30%～80%[7]。病毒病已经成为草莓生产上的主要病害之一,且至今没有发现任何特效药物或者通过有效的田间管理措施能防治病毒病[8]。运用组织培养技术培育草莓脱毒苗,已经成为目前恢复草莓品种特性和维持草莓优良性状的有效途径。根据组织培养选取的外植体不同,分为茎尖培养、叶片培养、叶柄培养、花药培养、原生质体培养及胚培养[9-14]。综合来看,草莓茎尖培养脱毒效果最好,是目前大规模生产培育草莓脱毒苗最广泛、最有效的途径[15]。

组培试验中常用的培养基为固体培养基,一般草莓外植体的培育采用MS培养基,同时需要配合使用细胞分裂素和生长素。穆廷云[16]研究发现不同种类不同剂量的生长调节剂,可以对草莓腋芽的发育方向产生影响。董敬超[17]、罗静静等[18]、王艳[19]研究结果表明,不同品种草莓因基因型不同,适合茎尖培养的附加激素也不同。因此,在对不同品种的草莓进行茎尖培育时,要选择适合的激素种类和剂量。

安徽地区的草莓种苗大多为本地留种,主要靠自繁自育的栽培模式,长期的无性繁殖方式和连续多年栽培没有进行种苗脱毒,使草莓的产量和品质受到了严重的影响。本试验通过实地考察安徽省草莓主产区长丰和阜阳地区相关基地,选择本地主栽的‘红颜’‘红花’‘天仙醉’‘越丰’‘雪兔’等5个品种为材料,建立5个不同品种草莓的茎尖脱毒培育快繁体系,旨在提升本地区草莓优质种苗的生产水平,扩大脱毒苗的使用面积,为促进草莓产业绿色健康发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 栽种在大棚里的草莓品种‘红颜’‘红花’‘天仙醉’‘越丰’‘雪兔’母株的匍匐茎。

1.1.2 基本培养基 MS+5 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖。

1.1.3 主要药品 植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和激动素(KT)等化学药品购于上海稼丰园艺用品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制及培养条件 在基本培养基中添加不同种类、不同浓度的植物生长调节剂,用1.0 mol/L KOH溶液调节,pH为5.8～6.0,分装后在121 ℃条件下灭菌20 min,备用。培养室温度控制在25 ℃,光照时间为12 h/d。

1.2.2 无菌苗获取 从田间选取生长旺盛、无病虫害的草莓植株匍匐茎,剪取长度为5～8 cm茎段,用洗衣粉溶液浸泡10 min,流水反复清洗直至干净。将沥干水后的匍匐茎用无菌水清洗2～3遍;用75%乙醇浸泡30 s,无菌水再清洗2～3遍,用0.1%氯化汞浸泡(浸泡时间见表1),最后用无菌水清洗5～6遍。将消毒后的材料在显微解剖镜下进行茎尖剥离,剥取长0.2～0.4 mm的茎尖接种到培养基中(基本培养基+0.2 mg/L 6-BA+0.02 mg/L IBA)。每处理接种10瓶,每瓶3个外植体。重复3次,30 d后统计苗的再生情况。

表1 不同氯化汞消毒时间对草莓茎尖分化的影响

1.2.3 试管苗增殖 将茎尖培养30 d获得的无菌芽苗分切成单株,接种于添加了不同浓度、不同种类的植物生长调节物的增殖培养基中,共36个植物生长调节剂处理和1个空白对照处理,每个处理接种10瓶,每瓶接种3株,重复3次。30 d后统计增殖系数。

1.2.4 试管苗生根 选取继代培养后长势较为健壮、高度3～4 cm的芽苗,去除根部残留物及多余茎叶,接入生根培养基中进行生根培养。生根培养基采用不加植物生长调节剂基本培养基,观察生根情况。

1.2.5 试管苗移栽 选取根部健壮、根长2～3 cm的组培苗进行穴盘移栽。基质成分质量比为草炭土∶珍珠岩∶蛭石=3∶1∶1,移栽时先将草莓苗根部的培养基洗净,放于0.1%多菌灵溶液中浸泡10 min,移栽至穴盘,基质喷洒透水,盖上透明薄膜及遮阳网。前期保证水分供应充足,14 d后统计成活率。

2 结果与分析

2.1 不同氯化汞消毒时间对草莓茎尖分化的影响

由图1和表1可知,在75%乙醇消毒相同时间下,0.1%氯化汞处理时间长短与草莓茎尖的成活率和污染率存在一定的关系。当氯化汞处理时间为2 min时,各个品种草莓茎尖污染率最高,其中‘红颜’的污染率为40.00%,‘红花’为33.33%,‘天仙醉’为40.00%,‘越丰’为46.67%,‘雪兔’为53.33%;随着氯化汞处理时间的增加,各草莓品种茎尖污染率逐渐呈降低趋势,成活率呈现先升高后降低趋势,且均在处理6 min时成活率最高,其中‘红颜’为66.67%,‘红花’为73.33%,‘天仙醉’为73.33%,‘越丰’为66.67%,‘雪兔’为60.00%。

图1 不同氯化汞消毒时间对草莓茎尖分化的影响Fig.1 Effects of different mercuric chloride disinfection time on shoot tip differentiation of strawberry

2.2 植物生长调节剂6-BA和IBA组合对各品种草莓试管苗增殖的影响

从表2可知,培养基中植物生长调节剂6-BA和IBA不同浓度组合对5种草莓苗的增殖影响不同。总体上看,IBA浓度相同时,随着6-BA浓度的增加,增殖系数呈现先增后减的趋势;当6-BA浓度一定时,随着IBA浓度逐渐增大,增值系数有逐渐降低的趋势,但各品种表现略有差异。植物生长调节剂0.4 mg/L 6-BA+0.06 mg/L I-BA组合时,‘红颜’最高增殖系数为5.38;植物生长调节剂为0.6 mg/L 6-BA+0.03 mg/L IBA组合时,‘红花’最高增殖系数为6.44;植物生长调节剂为0.2 mg/L 6-BA+0.06 mg/L IBA组合时,‘天仙醉’最高增殖系数为3.95;植物生长调节剂为0.2 mg/L 6-BA+0.06 mg/L I-BA组合时,‘越丰’最高增殖系数为5.75;植物生长调节剂为0.2 mg/L 6-BA+0.06 mg/L IBA组合时,‘雪兔’最高增殖系数为4.58。

表2 6-BA和IBA组合对草莓试管苗增殖的影响

2.3 植物生长调节剂6-BA和NAA组合对各品种草莓试管苗增殖的影响

表3显示,5个草莓品种在植物生长调节剂6-BA和NAA组合中增殖效果较差。当6-BA浓度一定的情况下,随着NAA浓度的提高各品种草莓增殖系数有降低的趋势; 当NAA浓度一定的情况下,随着6-BA浓度的变化各草莓品种增殖系数变化不明显。在各组合中,5个草莓品种的增殖系数在不同植物生长调节剂组合中也存在着一定的差异,其中‘红颜’增殖系数最高为3.12;‘红花’增殖系数最高为4.18;‘天仙醉’增殖系数最高为2.60;‘越丰’增殖系数最高为2.60;‘雪兔’增殖系数最高为3.08。

表3 6-BA和NAA组合对草莓试管苗增殖的影响

2.4 植物生长调节剂KT和IBA组合对各品种草莓试管苗增殖的影响

从表4可知,除‘红花’外,培养基中KT和IBA各种组合对其他4个草莓品种增殖影响并不明显,与空白对照相比,培养基中添加一定量的植物生长调节剂IBA或KT对草莓增殖也有一定的促进作用,但植物生长调节剂浓度变化对增殖系数影响不大。培养基中植物生长调节剂为1.5 mg/L KT+0.06 mg/L IBA组合时,‘红颜’增殖系数最高为4.00;植物生长调节剂为1.0 mg/L KT+0.03 mg/L IBA组合时,‘红花’增殖系数最高为5.08;植物生长调节剂为1.0 mg/L KT+0.03 mg/L IBA组合时,‘天仙醉’增殖系数最高为3.50;植物生长调节剂为1.0 mg/L KT+0.03 mg/L IBA组合时,‘越丰’增殖系数最高为3.15;植物生长调节剂为1.5 mg/L KT+0.06 mg/L IBA组合时,‘雪兔’增殖系数最高为2.70。

表4 KT和IBA组合对草莓试管苗增殖的影响

2.5 植物生长调节剂KT和NAA组合对各品种草莓试管苗增殖的影响

表5表明,植物生长调节剂KT和NAA组合对草莓增殖效果也不好,部分组合增殖效果与对照接近。其中‘红颜’增殖系数最高为2.50;‘红花’增殖系数最高为3.81;‘天仙醉’增殖系数最高为3.15;‘越丰’增殖系数最高为2.41;‘雪兔’增殖系数最高为2.70。而在2类植物生长调节剂高浓度组合(1.5 mg/L KT+0.09 mg/L IBA)时,各草莓品种增殖系数与空白对照接近,甚至低于空白对照,表现出一定的增殖抑制效应。

表5 KT和NAA组合对草莓试管苗增殖的影响

综合比较表2～5结果,用于草莓品种‘红颜’‘红花’‘天仙醉’‘越丰’‘雪兔’脱毒试管苗增殖的植物生长调节剂组合应首选6-BA和IBA组合,最适合上述5个品种脱毒试管苗的植物生长调节剂组合分别为MS+0.4 mg/L 6-BA+0.06 mg/L IBA、MS+0.6 mg/L 6-BA+0.03 mg/L IBA、MS+0.2 mg/L 6-BA+0.06 mg/L IBA、MS+0.2 mg/L 6-BA+0.03 mg/L IBA、MS+0.2 mg/L 6-BA+0.06 mg/L IBA。在基本培养基中添加上述植物生长调节剂组合,各品种草莓不仅增殖系数最高,且苗长势也较好,生产中可直接借鉴和应用。但6-BA浓度也不宜过高,在6-BA质量浓度达到0.6 mg/L时,‘红颜’‘天仙醉’‘雪兔’等3个品种试管苗均出现了不同程度的茎秆发红,苗老化、发脆的现象,增殖系数也出现了下降(图2A)。5个品种的草莓试管苗在不加任何植物调节剂的MS培养基中,苗增殖系数不高,虽叶色浓绿,但长势偏矮(图2B)。另外,在5个草莓品种试管苗增殖生产试验中不宜添加NAA,各品种试管苗均出现了不同程度的愈伤组织产生,且随着NAA浓度的升高,愈伤组织形成越多(图2D)。

图2 不同处理草莓试管苗的不同表现Fig.2 Different performance of strawberry test tube seedlings in different treatments注:A为6-BA浓度过高茎秆发红、叶片发脆;B为不添加植物调节剂的MS培养基正常试管苗;C为正常增殖的试管苗;D为添加高浓度NAA时形成的愈伤。

2.6 不同品种草莓试管苗移栽成活率比较

将生根后的草莓试管苗移栽后发现(图3),不同品种的试管苗在相同的生根条件下,成活率表现不同(表6)。

表6 不同品种草莓移栽成活率比较

图3 草莓试管苗生根炼苗状况Fig.3 Rooting and seedling refining of strawberry test tube seedlings

3 结论与讨论

在草莓组织培养快繁过程中,消毒剂的消毒效果在很大程度上影响草莓组织培养是否成功,相同浓度的氯化汞处理时间不同,对茎尖的消毒效果也不同。随着氯化汞消毒时间的增长,外植体的污染率逐渐降低,但同时外植体的成活率也逐渐降低,这可能是氯化汞对外植体本身活力造成了不可逆转的伤害引起的。因此,选择适合的氯化汞消毒时间对试验的成功至关重要。本试验表明,75%乙醇30 s加上0.1%氯化汞消毒6 min是该试验草莓茎尖消毒的最佳方式,与郭靖[20]的研究结果基本一致。

植物调节剂的种类、浓度以及组合方式是影响植物组织能否高效再生的关键,也是植物组织培养生产试验中不断探索的课题,组织培养能够顺利进行就是通过外源激素对植物生长和分化过程调节的结果[21]。前人研究结果表明,草莓茎尖的离体发育过程受多种激素共同协作调控[22-23]。本研究结果显示,在草莓芽苗的增殖过程中,不同品种对植物生长调节剂的种类、使用浓度的需求不同。颜昌敬[24]研究发现,草莓试管苗生根很容易,在不添加任何激素的培养基上就能生出大量根系;张建盈等[25]发现,不添加IBA的1/2MS培养基是‘白雪公主’草莓最适宜的生根培养基,生根率达100%。本研究虽然没有做草莓生根培养基的筛选,但在增殖过程中,试管苗在不同植物调节剂组合的培养基中生根状态也不同。为了使试管苗在移栽之前体内激素尽可能的低,本试验以不加任何植物生长调节剂的基本培养基为生根培养基,生根率也可达100%,且所有品种的草莓试管苗长势健壮,颜色浓绿,根系粗壮。