红地球葡萄生长素响应因子VvARF7基因克隆及其光响应分析

袁 苗, 刘 鑫, 党仕卓, 黄嘉俊, 高迎东, 周 娟, 张亚红

(宁夏大学农学院,宁夏 银川 750021)

花芽分化受内部因素(碳水化合物和激素等)和环境因素(光和温度等)相互作用的影响[1-3]。而光照作为植株生长发育的关键环境因素之一,对植株形态建成、物质组成和新陈代谢及生长发育相关基因的表达都有着巨大的调节作用[4]。有研究结果表明,植物对红光、蓝光有非常高的生物需求量[5],红光处理会提高樱桃番茄的单株产量,增加维生素C、可溶性糖以及番茄红素含量,蓝光处理则会缩短番茄果实转色时间,降低硝酸盐含量[6]。红/蓝(3∶1)或红/蓝(1∶1)组合光处理下番茄幼苗生长健壮,植株的干物质积累量大,果实品质较高,叶片厚度增大且光合作用、荧光特性较强[7]。红蓝复合光能够促进葡萄的光合作用,且可以增强抗氧化酶活性[8]。相较于自然光,比例为1∶4的蓝红光处理可促进火龙果花芽分化进程,提高花芽成花率与坐果率,从而提高了产量[9]。红光处理显著增加了铁皮石斛组培苗的根数和鲜质量,而红蓝绿复合光处理既提前了铁皮石斛的花期又提高了开花率[10]。此外,有研究结果表明,红蓝6∶1的组合光可提高不结球白菜和番茄内源激素脱落酸(ABA)、玉米素核苷(ZR)以及生长素(IAA)的含量[11]。

花芽分化是植物开花的前提,植物激素在这个过程中起调节作用,并在体内具有一定的动态平衡,且通过平衡互作调控参与植物花芽的分化过程,共同调节糖类的积累、运输及分配的各个过程,调控核酸、碳、氮等物质代谢[12]。生长素作为内源生长调节物质之一,在植物生长发育、阶段转变、成花诱导及花器官发育中扮演重要角色[13-15]。研究结果表明,IAA对于花芽生长发育的调控可能涉及参与细胞分裂和增殖的精确调控,而这一调控过程可能诱导更多的花芽形成[16]。

生长素响应因子(Auxin response factor,ARF)不仅是IAA信号调控途径中的重要调控因子,也是调节IAA参与植物响应生长素信号及外界环境信号的关键因子[17]。在大多数植物体内发现了ARF家族基因,比如拟南芥[18]、葡萄[19]、甜橙[20]、水稻[21]、番茄[22]等植物。ARF作为IAA信号途径的重要调控子,可以同下游生长素响应基因的启动子区域TGTCTC或TGTCCCAT结合,从而激活或抑制下游基因的表达,在生长素信号转导途径中具有关键作用[23-24]。研究结果表明,ARF转录因子基因表达量在花芽形成过程中有显著变化,对顶端分生组织的形成有显著作用[25]。在模式植物拟南芥中的研究发现,AtARF17促进花药发育和花粉管壁形成[26],AtARF1和AtARF2参与花器官的发育和凋谢过程等[17],拟南芥中AtARF6和AtARF8能够参与未成熟花雌蕊和雄蕊的发育过程[27]。桂花发育过程中,OfARF11、OfARF12、OfARF13和OfARF14可能对桂花的花期延长起到调控作用,该结果为ARF基因调控桂花花期的分子机制奠定基础[28]。梅花PmARF17能够促进雌蕊的正常发育[29]。此外,王景超等[30]发现,ARF在玉米雌花序发育的不同时期具有重要调控作用。

在设施栽培葡萄生产中,棚膜的老化,导致膜通透性降低,树木叶片遮光等环境因素会导致栽培设施内出现受光不足、受光不均匀等现象,最终导致葡萄花芽分化不良,影响产量和经济效益[31-32]。因此,设施增设发光二极管(LED)补光措施有助于葡萄花芽分化,然而具体的分子机制仍有待进一步研究。前期筛选出有利于花芽分化的最佳补光比例为:红光∶蓝光=4∶1[31],采取不同时期葡萄花芽进行转录组测序分析发现,VvARF7参与调节花芽分化的激素通路。本研究通过探索VvARF7基因在花芽分化中的功能,通过对其进行同源克隆、生物信息学和基因表达分析来挖掘该基因的光响应潜力,为后续深入开展葡萄花芽分化的分子机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年5月-2021年9月在宁夏银川市贺兰县园艺产业园(106°16′E,38°20′N)内进行。试验材料为10年生设施栽培红地球葡萄,株行距为0.8 m×1.5 m,每行6个生物学重复,行间利用反光膜进行分区。利用课题组前期试验筛选获得的最佳复合光补光比例,红光∶蓝光=4∶1(R4B1)处理葡萄,不补光作为空白对照(CK),光周期为16 h/8 h,补光时间由揭苫升温前至葡萄成熟。花芽采样时期参考路瑶等[33]对红地球花芽分化时间的划分,于5月中旬到9月初进行采样,每15 d采样1次,采取基部5～7个生长一致的芽,6个生物学重复。采集的葡萄花芽经液氮速冻后立即带回实验室,冻存于超低温冰箱用于后续试验。

RNA的提取、反转录和同源重组试剂盒、限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ均购自诺唯赞生物科技股份有限公司(南京),质粒小提试剂盒、纯化回收试剂盒及大肠杆菌感受态DH5α均购自天根生化科技有限公司(北京)。瞬时表达载体PBI221-GFP和根癌农杆菌菌株EH105均由宁夏大学贺兰山校区葡萄抗逆分子育种实验室提供。引物合成及测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 基因克隆

葡萄花芽总RNA提取参照植物总RNA快速分离试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司产品)说明书进行, 经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,通过NanoDrop测定浓度和纯度。参照反转录试剂盒说明书将葡萄花芽总RNA反转录为cDNA,首先去除基因组DNA,体系为5×gDNA wiper Mix 2 μl,RNA 1 000 ng,RNase-free ddH2O补齐至10 μl;反应条件:42 ℃ 2 min;cNDA合成:上一步的混合液10 μl,HiScript Ⅲ Enzyme Mix 2 μl, Random hexamers 1 μl,10×RT Mix 2 μl,Oligo (dT)20VN 1 μl,RNase-free ddH2O 补齐至20 μl,反应条件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 15 s,4 ℃ 5 min。

参考VvARF7基因编码区序列(CDS)并使用Primer 8.0软件设计特异性全长扩增引物VvARF7-F/R (表1),以红地球葡萄花芽的cDNA 为模板,使用高保真酶(南京诺唯赞生物科技有限公司产品)进行特异性扩增,扩增体系为:cDNA 2.0 μl,上下游引物各1.0 μl,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 12.5 μl,ddH2O 3.5 μl。扩增程序为:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,上述程序循环30次;72 ℃彻底延伸10 min;扩增完成后于4 ℃保存用于后续试验。

表1 本研究所用的引物序列

1.3 生物信息学分析

用DNASTAR软件和美国生物技术信息中心(NCBI)数据库BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)网络服务工具对核苷酸序列进行查询和比对;利用NCBI在线软件工具Conserved Domains Search预测保守结构域(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/);采用MEGA 12.0邻接法(Bootstrap为1 000)构建系统进化树;在Ensembl数据库(https://asia.ensembl.org/index.html)中搜索并下载VvARF7基因的起始密码子上游2 000 bp 的启动子序列,使用在线软件plantCARE进行启动子序列分析;采用在线软件ExPASy Proteomics server(https://web.expasy.org/protparam/)预测VvARF7基因编码蛋白质的理化性质;使用DNAMAN进行氨基酸序列相似性比对。

1.4 基因表达模式分析

根据葡萄VvARF7基因CDS设计实时荧光定量PCR(qRT-PCR)特异扩增引物(表1)。荧光定量仪为qTOWER 2.2(德国Analytik Jena公司产品),反应总体系为20 μl:2×ChamQ universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl,cDNA 1 μl,上下游引物各1 μl,ddH2O 7 μl。运行程序为:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,循环40次;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s;95 ℃ 15 s。

1.5 植物瞬时表达载体构建及亚细胞定位

设计植物过表达载体的特异性引物pBI221-GFP-VvARF7-F/pBI221-GFP-VvARF7-R(表1)。以葡萄花芽的cDNA为模板,利用纯化回收试剂盒回收VvARF7基因扩增产物和经XbaⅠ和XhoⅠ双酶切后的线性载体pBI221-35S-GFP,通过同源重组法将回收的PCR产物与酶切后的线性载体连接,产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞后,涂布于加有氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基上,37 ℃培养箱内倒置培养12 h,挑取单克隆进行菌落PCR检测,检测后,将正确的单克隆进行扩大培养,提取质粒,进行酶切检测,检测正确的送公司测序。构建好的融合载体pBI221-GFP-VvARF7通过电激转化法导入到农杆菌EH105中,检测正确的单克隆接种于50 ml含有利福平和卡那霉素的LB液体培养基中,28 ℃培养16 h,将菌液收集至50 ml离心管中,3 000 r/min离心10 min收集菌体,加入重悬液[10 mmol/L MgCl2,10 mmol/L 2-吗啉乙磺酸(MES)],使用移液枪吹散沉淀,再次离心10 min,弃去上清液,该步骤重复1次。上述步骤结束后,加入适量重悬液,使用移液枪吹散沉淀后,继续加入乙酰丁香酮 (AS,200 μmol/L)静置活化4～5 h后注射至烟草叶片中(6～8周),将黑暗环境培养24 h后的烟草转到正常生长环境培养2 d,剪取一小块本氏烟草叶片,用DAPI (4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚,核染料)染色(可利用10 ml注射器抽真空,使DAPI进入烟草内部,有利于染色),使用LeicaTC-SSP8X(德国Leica公司产品)共聚焦荧光显微镜观察本氏烟草叶片中融合蛋白的分布情况。

1.6 数据分析

用2-△△Ct方法计算基因相对表达量,3次重复。用Microsoft Excel 2010软件对数据进行处理,并采用IBM SPSS 26.0软件进行t检验比较差异显著性,然后使用Origin Pro 2021软件作图。

2 结果与分析

2.1 基因的克隆

根据目的基因的CDS设计同源克隆引物(表1),将提取的葡萄花芽总RNA反转录为cDNA后作为模板扩增,扩增结果如图1所示,将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后送上海生工生物工程股份有限公司测序,测序结果正确,VvARF7的CDS长度为3 468 bp,编码1 155个氨基酸(GenBank 登录号:XP 010656094.1)。

M:DL5 000 marker;1:VvARF7基因。图1 葡萄VvARF7基因扩增产物Fig.1 Amplification product of VvARF7 gene of grape

2.2 VvARF7转录因子特征及启动子分析

采用ExPASy分析VvARF7蛋白理化性质,结果显示,该蛋白质分子式为C5 652H8 815N1 651O1 781S37,相对分子质量为12 958,蛋白质等电点为6.66,不稳定系数为76.67,脂肪系数为68.39,平均亲水系数为-0.739,属于酸性不稳定亲水蛋白质。VvARF7的氨基酸组成中,Q谷氨酰胺(Gln)占比最高,为17.2%,C半胱氨酸(Cys)占比最低,为1.1%。分析VvARF7蛋白结构域,结果(图2a)显示,该蛋白质含有ARF转录因子特有的 B3 DNA结合结构域(126～227 aa)、Auxin_resp 域(258～334 aa)以及AUX_IAA结构域(1 040～1 112 aa)。对VvARF7蛋白二级结构进行预测,结果如图2b所示,VvARF7蛋白的结构分为α-螺旋结构、延伸链、β-旋转以及无规则卷曲,氨基酸残基所占比例分别为27.27%、14.63%、8.14%和49.96%。最后,对VvARF7蛋白三级结构进行预测,发现葡萄VvARF7基因编码蛋白质为多链折叠结构,该蛋白质多肽链的主要结构元件是无规则卷曲(图3c)。

a为VvARF7蛋白的保守结构域分析;b为VvARF7蛋白的二级结构(蓝色为α-螺旋,紫色为无规则卷曲,红色为延伸链;绿色为β-旋转);c为VvARF7蛋白的三级结构。 图2 葡萄VvARF7蛋白特征分析Fig.2 Characteristics analysis of VvARF7 protein in Vitis vinifera L.

VrARF7-like(XP 034700221.1):河岸葡萄;VvARF7(XP 010656094.1):葡萄;GhARF7 X1(XP 016753978.2):棉花;DzARF7-like(XP 022732351):榴莲;TwARF7-like(XP 038712736.1):雷公藤;PdARF7-like(XP 034224656.1):扁桃;AtARF7(AAG35177.1):拟南芥;RhARF7(QNN25870.1):蔷薇;ZmARF7(ADG43141.1):玉米;DcARF7(PKU86397.1):铁皮石斛;CnARF7(KAG1369998.1):椰子。图3 葡萄VvARF7蛋白与其他植物ARF7蛋白的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of VvARF7 protein of Vitis vinifera L. and other related plant species

VvARF7基因的启动子序列的分析结果(表2)表明,葡萄VvARF7基因启动子区域除存在TATA-box、CAAT-box等一些基本顺式作用元件(表中未列出)外,还存在光响应元件G-Box、Box 4、chs-CMA1a、TCT-motif和AAAC-motif,激素响应元件TGACG-motif、ABRE、AuxRR-core和TCA-element。

表2 VvARF7基因启动子顺式作用元件分析

2.3 VvARF7蛋白进化树和多序列比对分析

为了确定葡萄VvARF7蛋白与其他植物中VvARF7蛋白的进化关系,在NCBI中下载得到河岸葡萄(XP 034700221.1)、棉花(XP 016753978.2)、榴莲(XP 022732351)、扁桃(XP 034224656.1)、蔷薇(QNN25870.1)、雷公藤(XP 038712736.1)、拟南芥(AAG35177.1)、玉米(ADG43141.1)、铁皮石斛(PKU86397.1)以及椰子(KAG1369998.1)的ARF7蛋白序列,利用MEGA 12.0软件,采用邻接法对葡萄的VvARF7 (XP 010656094.1)蛋白和其他物种的ARF7蛋白进行系统进化树分析,结果(图3)显示,与葡萄VvARF7同源的蛋白质可聚为2类,其中葡萄VvARF7与河岸葡萄VrARF7亲缘关系最近,并与棉花、榴莲、扁桃、蔷薇、雷公藤、拟南芥聚为双子叶植物类,而玉米、铁皮石斛与椰子聚为单子叶植物类。

将VvARF7蛋白与其他7条相似度高的双子叶植物ARF7蛋白进行氨基酸多重序列比对,结果(图4)显示序列一致性为76.36%,均含有ARF转录因子特有的B3 DNA结合结构域、Auxin_resp结构域和AUX_IAA结构域。

2.4 葡萄VvARF7基因表达模式分析

葡萄花芽分化的关键阶段是花序分化,该阶段是决定葡萄有无花的关键[34]。在补光处理期间,本研究发现,在5月30日-8月15日葡萄花芽分化过程中红蓝(4∶1)复合光处理(R4B1)的VvARF7基因相对表达量低于不补光的对照组(CK)(图5),红地球葡萄花芽6月15日处于始分化期,6月15日及之前VvARF7相对表达量与对照组无显著差异。6月30日-7月30日花芽分化阶段处于原始体发育期、花序主轴发育和花序二级轴发育时期,在红蓝(4∶1)复合光处理下,VvARF7相对表达量显著低于CK且维持在一个低水平状态,表明VvARF7相对表达量低有利于葡萄花芽分化。较低水平的IAA有利于花芽分化[35],在整个花芽分化过程中,VvARF7基因在红蓝(4∶1)复合光处理下,在5月30日-8月15日较CK均下调表达,推测VvARF7有可能响应红蓝光并整合生长素和光信号参与葡萄花芽分化过程。

CK:不补光处理;R4B1:红蓝光补光处理。图5 VvARF7基因在花芽分化不同时期的表达Fig.5 Expression of VvARF7 gene during different stages of flower bud differentiation

为进一步了解VvARF7基因在葡萄不同组织中的表达情况,采用qRT-PCR对VvARF7在叶、花芽、根等组织中的相对表达量进行分析,结果(图6)显示,VvARF7基因在葡萄的各个组织中均有不同程度的表达,其中在卷须中的相对表达量最高,其次是根中,而在叶片中的相对表达量最低。这说明VvARF7基因在不同组织中的相对表达量存在差异,且可能在植物生长发育的不同阶段具有不同的作用。

图6 VvARF7基因在葡萄不同组织中的表达量Fig.6 Expression amount of VvARF7 gene in different tissues of grapes

2.5 葡萄VvARF7蛋白亚细胞定位

为探究VvARF7蛋白的亚细胞定位情况,将去除终止子密码子的CDS通过同源重组法与瞬时表达载体PBI221-GFP连接,形成重组质粒pBI221-GFP-VvARF7,经菌落PCR、酶切、测序鉴定正确后进行扩大培养,提取重组质粒,通过电击法将重组质粒转化至农杆菌EH105感受态,将农杆菌菌液注射到4～6周的本氏烟草叶片中,培养3 d后观察。结果如图7所示,融合蛋白VvARF7-GFP的绿色荧光分布在细胞核上,说明VvARF7蛋白定位于细胞核中,这与其作为转录因子的功能特点相符。

PBI221为阴性对照,Merged为GFP和DAPI信号融合;GFP为绿色荧光信号;DAPI为细胞核染料。比例尺=10 μm。图7 VvARF7蛋白亚细胞定位Fig.7 Subcellular localization of VvARF7 protein

3 讨 论

研究结果表明,光质可以调控生长素相关基因,并且可以介导光反应,两者相互作用共同调控植物的生长[36]。生长素相关基因响应光处理并参与植物的生长发育在模式植物拟南芥中有较多研究,Tian等[37]研究发现AtARF8基因表达受多种外源光的影响,如受红光、远红光、白光及蓝光诱导, 从而导致拟南芥arf8突变体子叶伸长,进而影响到拟南芥幼苗的正常生长发育;Vert等[38]研究发现在光诱导拟南芥幼苗发育过程中,AtARF2基因参与生长素途径和油菜素内酯途径,且与SK21蛋白存在相互作用;Folta等[39]发现蓝光诱导IAA1、IAA5和IAA18等基因,其相对表达量较对照组均有显著变化,表明这些基因参与拟南芥下胚轴生长的过程;Sun等[40]研究发现,IAA19的转录水平受到PIF4的调控,并且IAA19参与生长素介导的向光性生长反应。此外,刘帅等[31]发现植物激素信号转导相关基因响应红蓝复合光,参与葡萄花芽分化过程;Wang等[41]研究发现,与光照相比,OSARF1、OSARF2、OSARF16、OSARF21和OSARF23在黑暗条件下的相对表达量增加。

Reed[36]建议未来关于ARFs蛋白和Aux/IAA蛋白的研究应该侧重于其与生长素以及光信号的关系,并具体探究它们之间的相互作用机制。本试验克隆了设施红地球葡萄VvARF7基因,使用生物信息学分析软件对VvARF7蛋白进行生物信息学分析,结果表明,VvARF7基因编码1 155个氨基酸,该蛋白质的相对分子质量为12 958,由蛋白质结构预测结果可知,其含有β-旋转(8.14%)、延伸链(14.63%)、α-螺旋(27.27%)、无规则卷曲(49.96%)。系统进化树分析结果表明,VvARF7与河岸葡萄VrARF7-like进化距离最近,并且VvARF7蛋白定位于细胞核中,符合转录因子的特点。启动子分析结果表明,VvARF7基因的启动子区域具有大量光响应元件、茉莉酸甲酯和脱落酸等激素响应相关元件。本研究初步分析了VvARF7基因在设施栽培红地球葡萄花芽不同发育时期的表达情况,发现在花芽分化后期,VvARF7相对表达量在红蓝复合光处理下显著低于对照组,说明VvARF7基因可能响应红蓝光参与葡萄花芽分化。本研究结果显示,VvARF7基因在葡萄的多种组织中均有不同程度的表达,表明葡萄VvARF7参与多种组织生物学过程。花芽分化是大量基因参与调控形成的复杂的调控网络,课题组后期将对该类基因在花芽分化过程中的调控机理进行深入研究,并且进行转基因功能验证,以期为明确该基因的功能、解析设施红地球葡萄花芽分化分子机制提供理论参考。