基于TGF-β1/Smads通路的中医药治疗肝纤维化研究进展*

曹杨港 陈月桥 胡 锦 陈玮钰 陶 然 谭利婷 隆晓荣 毛德文△

1.广西中医药大学研究生院 (广西 南宁, 530001) 2.广西中医药大学第一附属医 院肝病科

肝纤维化(HF)是指因病毒性肝炎、酗酒、自身免疫性肝炎、代谢相关性脂肪性肝病和胆汁淤积性肝病等各种原因,导致肝细胞受损后再生,细胞外基质(ECM)在肝脏中弥漫性过度沉积与异常分布的疾病,是肝脏自身病理性修复反应。肝纤维化若未得到有效控制,会导致肝细胞结节样再生,形成假小叶结构,进展为肝硬化[1,2]。肝星状细胞(HSC)的活化是肝纤维化的关键环节,HSC激活后,转变为肌成纤维细胞(MFB),表达α-平滑肌动蛋白(α-SMA),同时合成ECM等,导致肝纤维化[3]。而转化生长因子β (TGF-β)、Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)、血小板衍生生长因子( PDGF)以及核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3(NLRP-3)/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)通路已被公认为HSC活化和纤维化进展的关键信号通路[4]。

目前,现代医学尚缺乏抗肝纤维化的有效治疗药物,而中医药抗纤维化效果显著,已得到业界广泛关注与认可。近年来,众多研究表明中医药可通过调控TGF-β1/Smads信号通路治疗HF,本文将对最新研究进展进行综述。

1 TGF-β1/Smads信号通路概述

TGF-β是转化生长因子超家族中的一种拥有广泛的生物学功能的多功能细胞因子,广泛参与调控细胞的增殖、分化、凋亡、免疫等过程,在哺乳动物中表现为TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3三个亚型,其中 TGF-β1为表达得最多最广泛的亚型[5]。TGF-β1作为一种体内平衡因子,在器官损伤或感染后保持免疫系统的平衡,并协调复杂的组织修复过程,其在组织器官纤维化的发生、发展中发挥重要作用[6]。TGF-β1主要通过TGF-β受体(TβR)传导信号发挥其生物学效应,TβR主要分为3型：TβRⅠ、TβRⅡ和TβRⅢ。传导信号主要通过其Ⅰ、Ⅱ型受体进行。当TGF-β1活化后,其与细胞膜上的TβRⅡ结合,然后吸附TβRⅠ并与其形成RⅡ-配体-RⅠ异源三聚体,TβRⅠ被TβRⅡ激酶磷酸化并被激活,活化的TβRⅠ磷酸化下游的Smads蛋白家族发挥信号传导作用[7]。TβRⅢ除了发挥辅助呈递作用外,最新研究发现其还可与Ⅰ型受体和Ⅱ型受体形成复合物,抑制TGF-β介导的Smad信号通路[8],此外其还参与介导TGF-β非经典信号通路[9]。

TGF-β1与相应受体结合后,传递信号至下游的Smads蛋白家族,Smad蛋白家族可分为3种类型,分别是受体调节型Smad(R-Smad)：Smad1、2、3、5、8;共同介质型Smad(Co-Smad)：Smad4;拮抗型Smad(I-Smad)：包括Smad6、7。R-Smad 可与活化的TβRⅠ直接作用并被磷酸化激活,TβRⅠ磷酸化其C末端SXS基序中的丝氨酸导致R-Smad活化,其中TGF-β/activin/nodal亚家族的I型受体ALK4/5/7主要磷酸化Smad2/3,而BMP/GDF/AMH亚家族的ALK2/3/6和ALK1主要磷酸化Smad1/5/8。R-Smad磷酸化后与Co-Smad结合组成异聚体并继续呈递信号。Co-Smad是需要与R-Smad形成异源寡聚物的一类Smad蛋白,其无法被其他任何受体磷酸化。Smad 4和多数R-Smad (除Smad 2外)的MH 1区有结合DNA的序列,其可结合磷酸化的R-Smad,发挥转录因子样作用。Smad主要起拮抗信号转导的作用,由于I-Smads和R-Smads拥有相似的结构,二者存在竞争性结合RI的关系,并且I-Smads能更优势的结合RI,所以 Smad6和Smad7可拮抗R-Smads的激活,Smad7是广谱抑制蛋白,可广泛抑制TGF-β家族,而Smad6则特异性的抑制BMP信号[10,11]。

2 TGF-β1/Smads信号通路在HF中的作用

TGF-β1是重要的促纤维化细胞因子,参与了组织器官纤维化发生发展的整个过程,TGF-β1的激活会导致胶原积累程序的启动,一方面有助于器官的损伤修复,但另一方面过度表达会导致ECM生成与降解的平衡被打破,参与组织器官纤维化的发生及进展。TGF-β1作为许多不同类型细胞的有效生长抑制剂,在控制实质细胞凋亡中发挥关键作用,并刺激ECM成分的产生。在HF发生过程中,TGF-β1对HSC的活化及HSC向MFB转化的起始、促进和进展至关重要,并且HSC自身可分泌TGF-β1,维持其自身的持续激活,TGF-β活性与数量的增加,使得ECM的生成和沉积增加,随后发生的上皮间质转化(EMT)也是HF发生和发展的关键环节[12],并且TGF-β1可抑制基质金属蛋白酶(MMP)的产生,同时促进金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)的生成,从而使得ECM的生成与降解严重失衡[13],造成进行性的瘢痕纤维化和器官功能丧失。而Smads蛋白家族是TGF-β1下游重要的细胞内效应子,介导信号传入细胞核,激活HSC,调节靶基因的转录,启动胶原基因表达[14]。综上,TGF-β1/Smads信号通路是HF发生发展的重要信号通路之一,靶向调控TGF-β1/Smads信号通路是重要的治疗策略以及科学研究的热点。

3 中医药干预TGF-β1/Smads信号通路治疗HF

3.1 中药单体成分及提取物 中药单体成分及提取物是中药发挥临床疗效的核心成分,提取有效成分有助于提高药物作用效率,相关的机制研究可精确定位其作用靶点及信号通路,有助于抗纤维化新药的研发与应用。

3.1.1 苷类 三七总皂苷是中药三七的有效提取成分,王京凯等[15]发现其可改善HF模型大鼠的肝纤维化,并且降低肝组织TGF-β1、Smad3以及其mRNA的表达,调控TGF-β1 / Smads信号通路的传导是其抗HF的可能机制。芍药苷是芍药的提取物,Ma等[16]发现其可降低辐射诱导的HF大鼠肝脏的羟脯氨酸(HYP)、透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC Ⅲ)及血清TGF-β1水平,同时下调Smad3/4的表达,上调Smad7表达,从而减少胶原沉积,拮抗HF。白首乌C-21甾体总苷是中药白首乌的提取物,张婷等[17]发现其可抑制人肝星状细胞内TGF-β1、p-Smad2/Smad2、pSmad3/Smad3、α-SMA及核因子κB( NF-κB)蛋白表达,并上调NF-κB的抑制蛋白(IκB),调节NF-κB/TGF-β1/Smad信号通路,抑制人HSC活化,是其抗HF的作用机制。

3.1.2 黄酮类 双氢杨梅素是中药藤茶中提取的黄酮类化合物,梁冰洁等[18]研究发现双氢杨梅素可改善HF小鼠肝组织I型胶原蛋白(CoⅡ)、ColⅢ水平,下调α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad4和其mRNA的表达,上调Smad7及其mRNA的表达,改善肝功能,减少肝脏胶原蛋白沉积,发挥其抗HF作用。 白背叶总黄酮是从中药白背叶中提取出的化合物,研究发现其可改善CCl4诱导的HF大鼠的肝功能指标,逆转肝纤维化,降低HYP、PC-Ⅲ、CoⅡ、HA及LN的水平,抑制了TGF-β1/Smad信号通路的传导和α-SMA的表达,提高抗氧化能力,减少HSC活化和ECM沉积[19]。甘草素是从甘草中提取的二氢黄酮单体复合物,Lee等[20]研究发现其可显著抑制CCl4诱导的HF大鼠的纤维化,阻断TGF-β1诱导的Smad 3磷酸化的同时,抑制了人肝星状细胞中纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)和MMP-2的转录水平,通过诱导YAP磷酸化增加了大抑癌基因蛋白1(LATS1)的活化,从而降低了YAP转录活性并遏制了TGF-β1/Smad信号通路的传导。

3.1.3 酚酸类 丹酚酸A是中药丹参的酚酸类提取物,吴雄健[21]使用丹酚酸A干预CCl4诱导的HF大鼠模型,研究发现丹酚酸A可明显降低TGF-β1、α-SMA和Smad3 mRNA和蛋白的表达,抑制TGF-β1/Smad信号通路来发挥拮抗大鼠HF的作用。没食子酸是从余甘子中提取的酚酸类化合物,Rasha等[22]研究发现其具有保肝和抗氧化作用,可改善硫代乙酰胺(TAA)诱导的大鼠肝纤维化情况,并下调TGF-β1、磷酸化Smad3蛋白和总Smad3蛋白肝内表达。此外,下调miR-21的表达,同时上调miR-30和miR-200表达,其效应是通过抑制TGF-β1/Smad3信号传导和差异化调节miR-21,miR-30和miR-200的肝脏表达水平来实现的。

3.1.4 萜类 莪术油是莪术的提取物,莪术醇是其中的活性成分之一,属萜类化合物,郑洋等[23]研究莪术醇抗肝纤维化的作用机制,发现莪术醇组小鼠Ishak评分及肝功能指标改善;莪术醇可下调实验组小鼠TGF-β1、Smad2/3 mRNA以及Smad2/3的表达。Chen等[24]利用网络药理学预测并通过动物实验以及转录组学技术验证了莪术油可通过调控TGF-β1/Smads通路发挥抗纤维化作用。

3.1.5 其他 大蒜素为药食两用的大蒜的提取物,李晓翠等[25]研究发现大蒜素可有效改善HF大鼠的肝功能、HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)水平以及胶原容积分数(CVF),显著降低肝组织中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、ColⅠ、Col Ⅲ的表达,进而减少ECM生成,显著改善HF。苦蘵睡茄内酯提取物是中药苦蘵提取出的主要含酸浆苦素型的化合物,体内外实验均证实其抑制YAP的表达及Smad2的磷酸化水平,下调YAP和TGF-β/Smad通路抑制HSC活化,有效减少ECM沉积,改善HF[26]。中药覆盆子,又称为红树莓,李彤等[27]研究发现,红树莓可改善HF大鼠的肝功能,且病理切片结果显示肝组织破坏程度降低,肝脏汇管区炎性细胞浸润及胶原沉积也显著减少,肝脏组织中TGF-β1蛋白表达显著降低,Smad7表达显著升高,通过干预TGF-β1/Smad信号通路起到抗HF作用。姜黄素是中药姜黄的提取物,细胞实验研究发现其可抑制HSC增殖,降低ColⅠ、Col Ⅲ、α-SMA、p-smad2和p-65的表达;动物实验表明姜黄素可有效改善CCl4诱导的HF和肝功能受损,抑制肝组织内p-smad2和p-65/NF-κB表达,下调TGF-β/smad2信号通路抑制HSC活化,从而减少肝脏内胶原的沉积[28]。

中药单体成分及提取物成分单纯,对其进行作用机制研究,有助于精确定位其靶点与通路,避免不同药物之间的串扰,单体成分及提取物的进一步提纯和多种成分的组合对于新型抗HF药物的研发与推广具有重大现实意义。但目前的研究大多以动物实验、细胞实验等基础研究为主,应尽快转入药物开发研究,进行临床实验,促进新型药物尽快问世并推广应用,此外目前的研究主要聚焦于机制研究及疗效研究,剂量探索研究较少,且缺乏安全性和耐受性研究,不利于进一步推广应用。

3.2 中药复方

3.2.1 中成药 中成药是在中医药理论指导下,以中草药为原料,加工配制而成的便于服用的制剂,具有服药便捷高效的优点,近年来基于TGF-β/Smads通路探讨中成药抗HF的机制研究同样取得了较多成果。丁茂鹏等[29]研究发现鳖甲育肝颗粒可改善HF大鼠肝功能及肝纤维化相关指标,还使TGF-β1及Smad3 mRNA表达明显下降,而Smad7 mRNA表达则明显升高。郭辉等[30]研究发现消炎利胆片、胆通颗粒均可改善胆汁淤积性早期HF大鼠的肝组织纤维化情况,同时降低了TGF-β1水平及Smad2、Smad3蛋白表达。彭孟云等[31]使用参仁活血颗粒干预CCl4诱导的大鼠HF模型,发现其能明显改善肝纤维化程度,降低TGF-β1、Smad3、Col I、Col 的表达,同时上调Smad7表达。 卢玮等[32]研究发现安络化纤丸可显著改善HF大鼠的肝纤维化,并下调TGF-β1、α-SMA及TGF-β1、Smad2/3的 mRNA表达,抑制HSC的激活,这可能是其抗HF的作用机制。曹婷婷等[33]发现紫七软肝颗粒可改善HF大鼠的肝功能及HF指标,降低肝组织氧化应激水平,使TGF-β1、Smad2、p-Smad2蛋白表达明显下降,其抗HF机制可能是调控TGF-β/Smad通路,抑制HSC的活化。张家富等[34]发现肝乐颗粒其可明显抑制肝组织中Collagen、TGF-β1、TβRⅠ、Smad2表达,可抑制HSC的激活与增殖,减少ECM的产生及在肝脏的沉积。刘慧敏等[35]研究发现六味五灵丸可抑制α-SMA、TGF-β1、Smad2/3的表达和Smad3的磷酸化,并上调Smad7的表达,从而减少肝脏胶原沉积,拮抗与逆转HF。代夏欢[36]研究发现独一味颗粒可抑制HF小鼠的Smad3、Smad3 mRNA表达,上调Smad7、Smad7 mRNA表达,改善肝脏病理改变,降低HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C水平,其抗HF机制可能与干预TGF-β1/Smads信号通路有关。

3.2.2 经典方剂 经典方剂是来源于中医典籍中的久经临床检验的有效方剂,且具备完整详备的理法方药体系,传承应用好经典方剂并通过科学研究阐释其科学内涵至关重要。刘世政[37]研究发现,小柴胡汤可改善大鼠HF,升高血清Alb,降低ALT、AST、HA、LN、PCⅢ,且肝脏中TGF-β1、Smad2、Smad3的表达水平降低,其抗HF的分子机制可能是调控TGF-β1/Smad信号通路。Zhou等[38]使用逍遥散干预CCl4诱导的HF大鼠,发现用药后HF大鼠的肝功能及HF程度均得到改善,同时α-SMA和ColⅠ的表达下降,利用转录组学分析以及网络药理学构建药物-成分-靶点网络,KEGG通路和GO富集分析表明,调控TGFβ1/Smad通路和Akt/FoxO3通路是其抗肝纤维化的机制。张建伟等[39]研究发现鳖甲煎丸能有效降低HF大鼠TGF-β1及Smad3的表达,提高Smad7的表达,改善肝细胞坏死变性,减少胶原沉着,减轻HF程度。柏干苹等[40]研究发现鳖甲煎改良方(原方减去药性峻猛,易伤正气的蜂房、鼠妇等,加茯苓、黄芪)同样能下调HSC-T6的TGFβ1、Smad3的表达,同时上调Smad7的表达,有效抑制HSC-T6的活化。

3.2.3 自拟经验方 在中医药探索抗HF治疗的漫漫征途中,涌现了大量简便廉验的经验方,经验方是中医经典理论、名医学术思想以及宝贵临证经验的智慧结晶,在中医抗HF治疗中占据重要地位。柔木丹是常占杰教授创制的治疗HF的经验方,由黄芪、皂刺、鳖甲、柴胡、赤芍、丹参等组成,具有柔肝软坚、活血消积的功效。李倩等[41]发现柔木丹可减轻模型小鼠的肝纤维化程度,降低血清中的ALT、AST、HYP的水平;减少CollagenⅠ、Ⅲ表达与胶原沉积,同时降低肝组织中TGF-β1、α-SMA以及Smad4表达强度,抑制HSC激活,减少胶原生成,抑制肝脏中ECM生成与沉着。扶肝化纤汤是治疗肝纤维化的经验方,由四逆散加三七、丹参、当归、鳖甲、黄芪,白术、绞股蓝、黄精组成,具有调和肝脾、活血化瘀之效。肖政华等[42]发现扶肝化纤汤可降低HSC-T6细胞中Smad3、α-SMA、ColⅠ的mRNA表达,增加Smad7 mRNA表达,通过调控TGF-β1/Smad信号传导通路,抑制HSC增殖和活化。柴竭抑肝纤是治疗肝纤维化的经验方,由柴胡、血竭、白芍、赤芍、当归、桃仁、红花等组成,具有疏肝健脾行气、活血化瘀散结之效,郭会君[43]发现其可显著下调HSC-T6细胞的TGF-β1、α-SMA蛋白、Smad 2、Smad 3及Smad 4 的mRNA表达,从而抑制HSC的活化与增殖发挥抗纤维化作用。疏肝健脾活血方是浙江名中医周庚生教授治疗HF的经验方,由茯苓、甘草、白术、桃仁、参三七、丹参等组成,具有疏肝健脾,活血软坚之功效,周凝[44]发现其含药血清可减少HSC的活化及ColⅠ的合成,同时下调Smad2、Smad3、Smad4及Smad7 mRNA的表达,通过调控TGF-β1/Smads信号通路来延缓HF进展。软肝散是张金良教授治疗HF的经验方,由柴胡、白芍、白术、莪术、鳖甲、淫羊藿等组成,具有调肝理脾软坚、补肾益精活血之效,刘定等[45]发现其可改善HF大鼠肝组织病理改变,减少肝组织中TGF-β1、Smad3蛋白的表达,干预TGF-β/Smad信号通路的传导,发挥拮抗HF的作用。

抗HF的中药复方组成以活血药、理气药、补益药等为主,大多具有调和肝脾、活血化瘀之效,复方相比单味药及提取物,可发挥药物协同作用,提升抗HF临床疗效,另一方面由于存在药物间协同及串扰机制,增加了作用机制研究的复杂性,今后可对复方中的单味药及成分进行逐一研究,对相关信号通路及靶点进行更全面探讨与总结,阐释其科学内涵,并筛选性能优良者,进行新的药物组合,开发疗效更为显著的新型复方制剂,此外也应当加强安全性及最佳给药剂量研究。

4 总结与展望

在目前现代医学对肝纤维化暂无有效治疗药物及治疗方案的大背景下,大量的基础研究及临床研究均证实中医药阻断和逆转HF的临床疗效显著。在我国,病毒性肝炎、酒精性肝病及代谢相关性脂肪性肝病等慢性肝病患者基数巨大,对HF进行定期的随访与及时的介入治疗是慢性肝病防治的关键,对于防止疾病进展为肝硬化、肝衰竭、肝癌等终末期肝病至关重要。近年来,中医药靶向调控TGF-β1/Smads信号通路对拮抗HF的相关研究取得了较大进展,为中医药治疗HF提供了科学依据,为进一步深入科学研究及临床应用推广奠定了坚实基础。

目前对中医药抗HF的基础研究较多,但研究成果转化及应用进展缓慢,研究局限于疗效评价及机制研究,应尽快促进中药药理评价向创新药物开发应用转变,同时要加强安全性研究及药代学研究。中医药治疗疾病具有多效应、多靶点、多通路的特点,目前的研究只集中在单一信号通路的研究,未能全面揭示中医药抗HF的科学内涵,今后的研究应对相关的靶点及信号通路进行更全面的研究与总结,并明确各通路的相互关系或协同作用机制。目前相关研究未重视中医证型的建模,今后对中医药抗HF的研究可建立相应证候模型,研究TGF-β1/Smads经典信号通路在不同证型中的差异化传导,从而更加符合中医药原创诊疗思维。临床工作中发现中医外治法干预HF也有着较好的疗效,但目前相关机制研究较少,今后可进行深入探讨,发掘更多抗HF的治疗手段。