矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制动力学

王 伟，崔 妍，郑明珠，蔡 丹，刘景圣，刘美宏，刘回民

（吉林农业大学食品科学与工程学院，小麦和玉米深加工国家工程研究中心，吉林 长春 130118）

2型糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的复杂代谢性疾病，其发病率在世界范围内呈现逐渐增高的趋势[1]。通过抑制消化酶（如α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）延缓肠道葡萄糖吸收是降低高血糖的有效手段[2]。阿卡波糖、伏格列波糖等常用于治疗糖尿病的药物，是通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性减少碳水化合物的水解。然而，这些药物会对人体产生一定的副作用，例如胃肠道不适、肝酶损伤、肾功能损害等[3-4]。因此，寻找具有轻微或无不良影响的新型α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶天然抑制剂应用于高血糖预防和治疗非常重要。研究指出，天然来源的植物多酚具有较强的消化酶抑制活性和较低的毒性[5]。任顺成等[6]发现栀子黄通过竞争性抑制的方式能显著抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的活性。此外，一些天然类黄酮化合物被发现可以通过非竞争性抑制模式显著抑制α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的活性，例如芹菜素、杨梅素以及槲皮素等[7-8]。

黑米花色苷（black rice anthocyanins，BRA）是黑米中的重要活性物质，主要是由矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）、花青素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷组成[9]。C3G属于多酚类黄酮物质，具有多种生物活性，如抗炎、抗胰岛素抵抗、调节血脂等[10]。已有研究发现，C3G可以抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，从而降低糖尿病小鼠的血糖水平并增强胰岛素敏感性[11-12]。然而，C3G对α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的具体抑制机制尚不清楚。因此，本研究通过酶动力学、荧光猝灭以及分子对接等方法对其抑制机制做进一步的解析，以期为其在降糖保健食品的应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶、猪胰α-淀粉酶、玉米淀粉 上海源叶生物科技有限公司；BRA、C3G 成都植标化纯生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Fluostar omega多功能酶标仪 德国BMG Labtech公司；SQP电子天平 德国Sartorius公司；1200高效液相色谱仪 美国Agilent公司；AllegraX-30R高速冷冻离心机 美国Beckman公司；LAMBDA365紫外-可见分光光度计 美国PerkinElmer公司；F7000荧光分光光度计日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果测定

采用PNPG法测定BRA对α-葡萄糖苷酶的抑制活性[13]。将25 μL的样品溶液与25 μL 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液混合孵育15 min后，加入50 μL 1 mmol/L PNPG底物溶液。加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液终止反应，随后使用多功能酶标仪在405 nm波长处测定其吸光度。

采用3,5-二硝基水杨酸法测定BRA对α-淀粉酶的抑制活性[14]。0.3 mL BRA溶液（1、3、5、7、9 mg/mL）加入0.3 mL 2.5 U/mL的α-淀粉酶溶液。混合液在37 ℃预热5 min，加入预温的1%淀粉溶液反应15 min。使用多功能酶标仪在540 nm波长处测定吸光度。

1.3.2 超滤-高效液相色谱分析

将20 μL BRA（10 mg/mL）、20 μLα-淀粉酶（10 mg/mL）和160 μL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）混合并孵育30 min。置于10 kDa分子质量的超滤离心管离心20 min以截留复合物，并洗涤除去未结合的组分。使用体积分数50%甲醇溶液使α-淀粉酶变性。Ultimate LP-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相A为甲醇，流动相B为0.5%甲酸溶液。洗脱方案如下：A相在0～2 min为90%，2～6 min为90%～80%，6～10 min为80%～70%，10～15 min为70%～65%，15～20 min为65%～50%，20～24 min为50%～10%，24～29 min为10%～90%，29～30 min为90%。柱温为30 ℃，流速为1 mL/min。结合率按下式计算：

式中：Aa为超滤筛选前各化合物色谱峰面积；Ab为亲和筛选作用后活性酶结合的各化合物色谱峰面积；Ac为与变性酶结合的各化合物色谱峰面积。

1.3.3 酶抑制动力学

酶抑制动力学测定按照经典方法进行，略有修改[15]。具体如下：底物PNPG浓度调整为1 mmol/L，设定不同浓度α-葡萄糖苷酶（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 U/mL），添加不同浓度的C3G。根据酶浓度与酶反应速率变化关系图，判断酶促反应是否可逆。在α-葡萄糖苷酶（0.5 U/mL）的条件下，随着PNPG浓度（0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L）增加，确定C3G对α-葡萄糖苷酶活性的抑制模式。

α-淀粉酶动力学研究是根据1.3.1节反应条件与各种质量浓度（0、1、3、5 mg/mL）的抑制剂进行，并且底物的质量浓度范围规定在5～15 mg/mL。同时，以1/V对不同质量浓度底物的抑制剂质量浓度作图获得α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制剂常数[16]。

1.3.4 紫外吸收光谱测定

根据刘硕等[17]的方法稍作修改。C3G溶液与α-淀粉酶溶液/α-葡萄糖苷酶溶液的质量浓度比为0∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1，振荡摇匀。在室温下反应15 min后，在200～400 nm波长范围测定混合液的紫外吸收光谱。

1.3.5 荧光光谱学测定

配制成酶-抑制剂混合体系：300 μLα-葡萄糖苷酶溶液和100 μL不同质量浓度的C3G溶液（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL）。测定混合体系荧光强度，发射波长为300～450 nm，狭缝宽度为10 nm。α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶荧光光谱测定方法类似，其中C3G溶液质量浓度分别为0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL。对照组：磷酸盐缓冲液代替C3G。结合常数（Ka）、荧光猝灭常数（Kq）和结合位点数（n）按式（2）和（3）计算：

式中：F0和F分别为α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶在没有抑制剂和有抑制剂的情况下的荧光强度；Ksv为Stern-Volmer猝灭常数；τ0为不存在猝灭剂时荧光团的平均寿命（其值约为10-8s）；[Q]为C3G的质量浓度/（mg/mL）；[P0]为α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶的质量浓度/（mg/mL）。

1.3.6 分子对接实验

采用AutoDock 4.2分子模拟软件进行分子对接，预测C3G与两种酶的结合模式和作用力。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的PDB编号分别为3WY2、1DHK。酶蛋白结构从UniProt（https://www.uniprot.org/）获取，C3G小分子结构从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取。结合能被用来评估酶蛋白与小分子的结合亲和力。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 BRA对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用

膳食淀粉可以被α-淀粉酶消化成还原糖，接着再被α-葡萄糖苷酶消化为葡萄糖，从而导致2型糖尿病患者的餐后血糖水平升高[18-19]。因此，抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性对于延缓碳水化合物降解和葡萄糖吸收至关重要。本研究发现BRA对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性，且对α-葡萄糖苷酶的抑制呈现剂量依赖性。由图1A可知，当BRA质量浓度达到0.1 mg/mL时，其抑制率达到了81.22%。BRA对α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的抑制效果可以通过半数抑制浓度（IC50）表示，即BRA引起的α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶活力降低50%的结果。通过线性拟合计算得出，阿卡波糖（IC50=0.214 μg/mL）对α-葡萄糖苷酶的抑制效果高于BRA（IC50=13 μg/mL）。此外，图1C、D显示，BRA对α-淀粉酶的抑制作用与质量浓度呈正相关，且抑制效果低于阿卡波糖。同时，发现BRA对α-淀粉酶的IC50（1.141 mg/mL）远大于α-葡萄糖苷酶，其原因可能是α-淀粉酶与BRA中活性物质的亲和能力比α-葡萄糖苷酶更弱。总而言之，BRA对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有较好的抑制作用，可能作为潜在的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂。

图1 BRA和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶（A、B）和α-淀粉酶（C、D）的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of BRA and acarbose against α-glucosidase(A and B) and α-amylase (C and D)

2.2 BRA的高效液相色谱分析

对BRA进行超滤-高效液相色谱分析，以鉴定出BRA中与酶蛋白结合的主要活性成分。如图2A所示，超滤筛选前BRA提取物高效液相色谱图中第3个样品峰的出峰时间为13.250 min，与图2B中C3G标准品的出峰时间一致，表明C3G是BRA的主要组分。此外，由图2C可知，BRA中C3G与α-淀粉酶发生特异性结合后，活性酶组所捕获的配体所对应的波峰的强度与面积均大于失活酶组。因此，可以通过比较波峰面积反映C3G与α-淀粉酶的结合率。高效液相色谱图数据显示Aa=3421.62549、Ab=353.69589、Ac=48.32920，通过式（1）计算得C3G与α-淀粉酶的结合率为8.9%。由此可知，BRA中的C3G是对α-淀粉酶发挥抑制作用的主要活性成分。

图2 BRA的高效液相色谱图Fig.2 High performance liquid chromatogram of BRA

2.3 α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶的抑制动力学分析

对酶抑制剂的C3G单体进行动力学研究，以揭示C3G对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制机制。通过Lineweaver-Burk和Dixon图确定C3G对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制模式[20-21]。如图3A、C所示，所有直线都经过原点，并且所有直线的斜率随着C3G质量浓度增加而减小，这表明C3G作为两种酶蛋白的可逆抑制剂发挥作用。图3B、D显示，不同反应体系的抑制曲线交点无限收敛于x正半轴。此外，Vmax持续下降，而Km值几乎没有变化，这表明C3G作为两种酶蛋白的非竞争性可逆抑制剂起到了抑制作用（表1、2）。对于非竞争性可逆抑制，以Lineweaver-Burk方程中1/Vmax对相应的抑制剂浓度I进行二次绘图得到直线的横轴截距，可求出抑制常数Kiu[22-23]。1/Kiu值被用来衡量抑制剂与酶的亲和力程度[24]。Dixon图结果表明，α-葡萄糖苷酶与C3G（Kiu=0.05）间的相互作用比α-淀粉酶与C3G（Kiu=3.723）间的相互作用更强，这与酶活性抑制的结果保持一致（图3）。因此，C3G以可逆非竞争性的方式抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，且与两种酶蛋白的亲和程度有差异。

表1 C3G抑制α-淀粉酶的Vmax和Km值Table 1 Vmax and Km values of C3G against α-amylase

表2 C3G抑制α-葡萄糖苷酶的Vmax和Km值Table 2 Vmax and Km values of C3G against α-glucosidase

图3 C3G对α-葡萄糖苷酶（A）与α-淀粉酶（C）的可逆抑制作用以及对α-葡萄糖苷酶（B）与α-淀粉酶（D）的双倒数曲线图Fig.3 Reversible inhibition of α-glucosidase (A) and α-amylase (C) by C3G and double-reciprocal curves for α-glucosidase (B) and α-amylase (D)

2.4 α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶的紫外吸收光谱分析

如图4所示，复合物体系在295 nm处有吸收峰且发生红移现象（295～305 nm）。此外，固定α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶浓度，吸光度随着C3G溶液质量浓度的增大而增大。因此，这表明C3G与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用，使α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的肽键C＝O基团的π-π*发生跃迁，导致酶的能量与活性降低。

图4 C3G质量浓度对α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）紫外吸收光谱的影响Fig.4 Effect of different concentrations of C3G on the UV absorption spectra of α-amylase (A) and α-glucosidase (B)

2.5 C3G对α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭效应

荧光光谱通过测量荧光强度和最大发射波长的变化监测α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶中色氨酸残基的微环境变化[25-26]。如图5A所示，随着C3G质量浓度增大，α-淀粉酶中色氨酸残基的荧光强度显著降低，荧光光谱发生明显猝灭现象。在添加不同质量浓度C3G（0～6 mg/mL）的过程中，最大发射波长出现明显的蓝移现象（375～350 nm），这意味着C3G与α-淀粉酶的结合引起了色氨酸残基周围的疏水性变化。同样地，C3G质量浓度增大导致α-葡萄糖苷酶荧光强度呈规律性降低。此外，明显的红移（339～390 nm）现象表明，C3G会引起α-葡萄糖苷酶疏水键的断裂，导致色氨酸等非极性氨基酸残基暴露于极性环境中。

图5 C3G质量浓度对α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）荧光猝灭强度的影响Fig.5 Effects of different concentrations of C3G on the fluorescence quenching spectra of α-amylase (A) and α-glucosidase (B)

因此，C3G是α-淀粉酶/α-葡糖苷酶荧光的猝灭剂，并改变了α-淀粉酶/α-葡糖苷酶的特定结构变化，这与高效液相色谱得出的结果保持一致。利用荧光色谱数据进一步分析得出α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭速率常数Kq=1.3×1012L/（mol·s），α-淀粉酶的荧光猝灭速率常数Kq=3.8×1011L/（mol·s）。此外，两种糖苷酶的荧光猝灭速率常数Kq大于2×1010L/（mol·s），进一步得出C3G荧光猝灭α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的过程不是由分子扩散和动态碰撞引起的动态猝灭，而是形成复合物的静态猝灭过程。总而言之，C3G在疏水作用力驱动下可与两种酶结合生成复合物，从而引发酶的结构发生变化，导致酶的活性降低。

2.6 分子对接分析

分子对接被应用于通过非共价键形成双分子复合物的分析，主要包括疏水力和氢键[27]。通过该分析方法，获得化合物与蛋白质相互作用的结合亲和力和氨基酸残基。经线性拟合计算后，发现C3G与α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶可能存在1 个最佳结合位点（表3）。结合能Eb表示测试化合物对酶蛋白的结合亲和力[28]。由表3可知，C3G与α-淀粉酶的电离能Eb为-7.8 kcal/mol，而与α-葡萄糖苷酶为-9.8 kcal/mol。此外，C3G与α-葡萄糖苷酶之间的结合亲和力比α-淀粉酶高，这与荧光猝灭常数Kq和抑制常数Kiu结果一致。此外，Eb值均为负值，表明C3G-淀粉酶结合的相互作用是一个放热过程。

表3 α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的荧光参数Table 3 Fluorescence parameters of α-glucosidase and α-amylase

分子对接结果预测C3G与位于α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶非催化位点的氨基酸残基相互作用，可能扰乱蛋白质结构，并以非竞争方式抑制酶活性，进而改变酶活力。如图6E所示，C3G与α-淀粉酶结合位点附近对结合作用贡献较大的氨基酸残基为ASP316、LEU181、ALA214、TRP77和GLN81。与此同时，C3G和α-葡萄糖苷酶之间形成了4 个氢键（THR445、ARG429、ASP441、ASN46）相互作用。图6F显示，当与α-葡萄糖苷酶结合时，C3G主要被氨基酸残基HIS348、THR445、ARG429、HIS515、ASN46、GLU432、GLN438和ASP441包围。此外，这些氨基酸残基增加了抑制剂-酶复合物的稳定性。总而言之，C3G可能是α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的潜在配体，通过非共价力与关键氨基酸残基相互作用，发挥其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

图6 C3G与α-淀粉酶（A、C、E）和α-葡萄糖苷酶（B、D、F）的分子对接结果Fig.6 Molecular docking results of C3G with α-amylase (A,C and E) and α-glucosidase (B,D and F)

3 结论

本研究揭示BRA中的C3G对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制机制。结果表明，C3G与两种酶的结合过程是自发的，生成酶-抑制剂复合物，导致α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的内在荧光猝灭。此外，该抑制作用属于非竞争性可逆抑制。C3G与ASP441、TRP等残基以氢键结合，并与周围众多的疏水残基存在疏水作用，共同维持复合物的稳定结构。本研究对于开发新型的食源性α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶抑制剂，推动C3G在功能性食品领域的应用具有一定的参考价值。