嗜热小孢根霉GH134家族甘露聚糖酶基因的克隆表达及在果汁加工中的应用

刘 学，韩 璞，陈 伟，田洪涛，谷新晰,

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；2.河北保定第二中学，河北 保定 071000）

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一类作用于β-1,4-甘露糖苷键的内切水解酶，广泛分布于软体动物、植物和微生物中，其中微生物来源的甘露聚糖酶资源最为丰富[1-3]。作为一种新兴的食品加工用酶，甘露聚糖酶可应用在寡糖的制备[4]、面包品质的改良[5]、乳制品增稠加工[6]及果汁饮料稳定性等领域[7]。Shimizu等[8]在构巢曲霉中首次发现了一个全新的甘露聚糖酶家族，归类为GH134家族。不同家族的甘露聚糖酶之间差异较大，但是GH5、GH26和GH113家族甘露聚糖酶的分子结构却表现出较大的相似性，呈典型的(β/α)8-TIM桶状结构，属于GH-A超家族[9-11]。而GH134家族甘露聚糖酶的分子结构表现出明显差异，其结构主要是呈现一种α/β折叠结构[12]。目前，GH5家族和GH26家族来源的甘露聚糖酶被进行了广泛研究，而另外两个家族，尤其是GH134家族甘露聚糖酶报道的信息较少。到目前为止，只有数个GH134家族甘露聚糖酶被报道，这使得该类家族甘露聚糖酶的信息极为有限，限制了该类酶的进一步应用。

大曲是中国特有的一类糖化发酵剂[13]，在发酵食品的生产中已经使用了几个世纪，菌种具有较高的生物安全性能[14]。大曲往往被用在谷物的固态发酵生产中，谷物中富含纤维素、半纤维、淀粉和果胶等多种物质，这为多种微生物的生长提供了丰富的底物[15-17]，同时固态发酵生产温度偏高（50～70 ℃），大曲中功能微生物的挖掘已成为研究热点。

近年来，由于消费者对健康、天然、绿色诉求的不断增强，果汁饮料市场迅速扩大。目前，果胶酶[18]、淀粉酶[19]和纤维素酶[20]等广泛应用在果汁加工中。然而由于水果种类众多，造成不同水果出汁率、澄清度的因素存在差异，挖掘新型果汁加工用酶一直是人们追求的目标。Nadaroglu等[21]首次对甘露聚糖酶在果汁中的应用进行探索，发现甘露聚糖酶可以在果汁澄清中发挥重要作用。本课题组前期探究了GH5家族甘露聚糖酶NsMan5B对果汁澄清效果的评价[22]，发现除橘子汁外，该重组酶对其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中柿子汁澄清度提高了31.8%，苹果汁、桃汁、葡萄汁的澄清度分别提高7%、4%和4%。而关于GH134家族的甘露聚糖酶在果汁加工的应用还鲜有相关报道。

本研究拟对嗜热真菌小孢根霉（Rhizopus microsporus，Rm）HBFH10中GH134家族甘露聚糖酶基因进行克隆、表达及酶学性质的研究，探究其在果汁加工过程中的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大曲来自河北凤来仪酒业有限公司；毕赤酵母GS115和质粒pPIC9k均由本实验室保存。

TransI-T1、FastpfuDNA聚合酶 北京全式金生物技术有限公司；T4DNA酶和EcoR I、NotI、BglII限制酶宝生物工程（大连）有限公司；蛋白定量试剂盒 美国Bio-Rad公司；真菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；角豆胶、魔芋粉、瓜尔豆胶 美国Sigma公司；羧甲基纤维素钠、果胶 绿叶生物科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

BMGY（buffered glycerol-complex）培养基、BMMY（buffered methanol-complex）诱导培养基、MD（minimal dextrase）琼脂板参照毕赤酵母表达手册；筛选培养基：10.0 g/L (NH4)2SO4，1.0 g/L KH2PO4，0.1 g/L FeSO4·7H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O，8.0 mg/L MnSO4·5H2O，0.3 g/L魔芋粉，pH 6.0；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

立式高速低温离心机 日本Hitachi 公司；Tprofessional聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 德国Biometra公司；TU-1810 紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；电穿孔仪美国伯乐公司；蛋白超滤系统 德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 嗜热真菌筛选

将1 g大曲样品充分与100 mL无菌水混匀，取上层菌液涂布至筛选培养基平板，并置于45 ℃培养箱中培养2～5 d。挑取单菌落接种至PDA平板中，并分别在19 ℃和45 ℃条件下，观察其生长情况，参照嗜热真菌筛选标准，选取能够在45 ℃正常生长，而在19 ℃不能生长的真菌，4 ℃保存备用。

1.3.2 菌株的鉴定

将45 ℃培养的单个菌株（HBFH10）接种在PDB培养基中，30 ℃培养72 h后，离心收集菌体。利用真菌基因组提取试剂盒进行总DNA的提取，-20 ℃保藏备用。菌株鉴定采用内转录间隔区（internal transcriptional spacer，ITS）鉴定方法，将扩增获得的PCR产物（800 bp）连接至pEASY-T3载体中，并热激转化至Trans1-T1宿主，阳性转化子送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。采用MEGA7.0软件构建进化树，进行菌株的分类分析。

1.3.3 GH134家族甘露聚糖酶兼并引物设计及甘露聚糖酶基因的克隆

从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，收集已知G H 134 家族的氨基酸序列，通过比对分析设计GH134家族的兼并引物：Man134UFAAYTTYGGYATHTTYAARCARAAYTGG和Man134URACRTCVACCCARAARCGMGTRTCRTC，采用兼并引物扩增GH134家族基因的部分序列，通过琼脂糖电泳检测扩增产物，将符合大小的片段和pEASY-T3载体进行连接，并转化至Trans1-T1宿主，阳性转化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

参考RmATCC 62417 中的假使蛋白（CEG81741.1）序列，设计引物：RmMan134FATGCTCGTCAAGTACTTTGCTCTTTTCC和RmMan134R-TTAGATAGGGGTAACGTCGACCCAG，将PCR扩增产物进行回收后连接pEASY-T3载体，并转入Trans1-T1宿主，阳性转化子由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.3.4RmMan134基因生物信息分析

使用Vector NTI 11.0软件对测序结果进行分析。使用FGENESH（http://linux1.softberry.com/）软件对基因的内含子和外显子位点进行预测分析。使用BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对基因序列进行比对分析。使用ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）在线工具预测酶蛋白的分子质量和等电点。使用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）软件进行酶蛋白信号肽位点分析。使用NetNGlyc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）在线工具进行酶蛋白分子的N-糖基化位点分析。

1.3.5 重组甘露聚糖酶菌株的构建

依据RmMan134基因序列设计表达引物RmMan134PFCGGAATTCAGACCCGGCGATAGAGGCCACTAC和RmMan134PR-GAATGCGGCCGCTTAGATAGGGGTAAC GTCGACCCAG，进行PCR构建pMDTM19T-RmMan134质粒，随后与质粒pPIC-9k分别进行EcoR I和NotI双酶切处理，并进行连接构建重组表达质粒pPIC9k-RmMan134，阳性转化子由生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。提取pPIC9k-RmMan134质粒并利用限制性酶BglII线性化，将产物电转化至GS115感受态，参照毕赤酵母表达手册方法和酶活性筛选方法对转化子进行筛选，获得阳性转化子。

1.3.6 重组菌株诱导表达及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

挑取阳性转化子至50 mL酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，30 ℃、250 r/min培养12 h后，以1%（V/V）的接种量转接种于200 mL BMGY中，30 ℃摇床培养48 h。离心收集菌体并转接至200 mL BMMY培养基，添加并维持甲醇终体积分数为0.5%，30 ℃摇床培养72 h。离心收集发酵液，即为粗酶液，进行酶活力测定及SDS-PAGE分析。

1.3.7 酶活力测定

参考Miller[23]的3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）方法。取100 µL适当稀释酶液和900 µL 5 mg/mL角豆胶溶液，在pH 5.050 mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，50 ℃反应10 min后，加入1.5 mL DNS终止反应。对照则在加入1.5 mL DNS后，补加100 µL稀释酶液。沸水浴5 min并冷却至室温后在540 nm波长处测定吸光度。以每分钟生成1 µmol甘露糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（IU）。

1.3.8 甘露聚糖酶酶学性质分析

1.3.8.1 pH值对重组酶RmMan134活性的影响

在pH 2.0～12.0范围条件下，按照1.3.7节方法测定重组酶RmMan134酶活力，以酶活力最高值为100%，探究该酶的pH值工作区间。在pH 2.0～12.0条件下，将重组酶RmMan134在37 ℃处理1 h后，测定酶活力，以未进行处理的酶活力为100%，探究重组酶的pH值耐受性。

1.3.8.2 温度对重组酶RmMan134活性的影响

在30～70 ℃范围条件下，按照1.3.7节方法测定重组酶RmMan134酶活力，以酶活力最高值为100%，测定重组酶的反应温度范围。将重组酶在50 ℃和60 ℃下，分别孵育0、5、10、20、30 min和60 min，测定酶活力，以未处理酶活力值为100%，探究该酶的热稳定性。

1.3.8.3 重组酶RmMan134动力学参数及底物特异性测定

按照1.3.7节方法，以不同质量浓度角豆胶（10、8、6、5、4、3、2 mg/mL和1 mg/mL）为底物测定重组酶RmMan134酶活力，依据米氏方程双倒数法（Lineweaver-Burk法）求得Km和Vmax。

按照1.3.7节方法，测定重组酶RmMan134对不同底物（角豆胶、魔芋胶、果胶、羧甲基纤维素钠和木聚糖）的降解能力，探究重组酶的底物特异性。

1.3.9 重组酶RmMan134在果汁加工中的应用

选取新鲜、完整、成熟的橙子、杏、葡萄、苹果和桃，进行清洗、晾干处理，参照朱丹实等[24]方法制备果浆。每10 g果浆添加2 mL酶溶液（对照组添加2 mL蒸馏水替代）混匀，50 ℃条件下酶解1 h，保存4 ℃备用。

果汁出汁率测定[25]：酶解后的果浆经200 目滤布过滤15 min，收集果汁并测定其体积。出汁率按下式计算：

果汁澄清度测定[26]：经8000 r/min离心12 min后，取上清液在波长660 nm处测定透过度，蒸馏水为对照，以透光率（%）表示。

果汁总还原糖测定[27]：采用DNS比色法进行果汁还原糖的测定，以每毫升果汁中葡萄糖含量（mg/mL）表示。

1.4 数据分析与处理

实验重复测定3 次，利用Excel 2019和SPSS 19.0软件对测定结果进行统计分析，数据结果以表示。

2 结果与分析

2.1 嗜热菌HBFH10的分离及鉴定

从河北省凤来仪酒业有限公司大曲中筛选获得1 株真菌HBFH10，经菌株生长温度测定结果（图1A、B）可知，菌株HBFH10在19 ℃下无法正常生长，而能够在45 ℃条件下正常生长，符合嗜热真菌生长温度特点要求，判定HBFH10菌为嗜热真菌。

图1 菌株HBFH10菌落形态及进化树Fig.1 Morphology and evolutionary tree of strain HBFH10

使用ITS1和ITS4引物进行18S基因间隔区域的扩增，最终获得800 bp左右PCR产物。利用BLAST软件分析发现与Rmstrain D4-1（GQ502280.1）一致性最高，为99%，通过进化树分析菌株HBFH10属于Rm，最终将该菌命名为RmHBFH10。

2.2 甘露聚糖酶RmMan134基因序列分析

经对多条GH134氨基酸序列对比发现，该家族甘露聚糖酶存在2 个保守区域，如图2所示。保守I区序列（NFGIFKQNW），活性催化位点位于该区域中，该区域结构主要为Loop结构，由于Loop结构具有较强的柔性特点，这为底物的识别及催化提供了便利；保守II区序列（DDTRFWVD），该区域相对而言最为保守，该区域主要是β折叠片结构。在上述两区域设计GH134家族的兼并引物。本研究利用兼并引物Man134UF和Man134UR对RmHBFH10基因组DNA进扩增，获得1 个基因保守片段，测序结果表明该基因为GH134家族的甘露聚糖酶基因的部分序列，并且与菌株RmATCC 52813基因组中的假使蛋白基因（CEG81741.1）序列一致性为98%。进一步分析发现RmMan134基因由552 bp碱基组成，没有内含子序列，编码183 个氨基酸和1 个终止密码子。

图2 甘露聚糖酶RmMan134序列对比分析Fig.2 Amino acid sequence alignment of RmMan134

RmMan134基因与已报道的GH134家族甘露聚糖酶的一致性对比分析，该基因与已报道GH134家族基因的氨基酸序列一致性较低（＜69.6%），表明RmMan134基因具有一定的新颖性，具有理论研究价值。其中与甘露聚糖酶AoMan134（XP_023093135.1）一致性为45.2%，与甘露聚糖酶SsMan134（PDB，5JTS）一致性为51.6%，与甘露聚糖酶RmMan134A（MF538624）一致性为69.6%，与甘露聚糖酶AnMan134（ANID_02710）一致性为51%。RmMan134具有α/β结构，属于Clan-A超家族，含有催化保守氨基酸（E55和D67），分别位于第2个和第3个α螺旋结构中。

2.3 重组菌RmMan134基因诱导表达及产物的SDSPAGE分析

表达质粒pPIC9k-RmMan134经BglII限制酶线性化后，电击转入毕赤酵母GS115感受态细胞，在MD平板上培养，挑取48 个转化子进行小管诱导，毕赤酵母采用两段法进行异源基因诱导表达。从48 个转化子中筛选得到32 株具有甘露聚糖酶活力的转化子。将重组菌株进行诱导表达之后，对细胞发酵液进行酶活力检测，发酵液中酶活力为7.8 U/mL。发酵酶液800 mL经12000×g离心10 min去除酵母细胞及培养基，收集上清液，之后将上清酶液进行膜包（10 kDa）浓缩处理，使浓缩后的酶液为30 mL左右。经SDS-PAGE检测重组酶RmMan134表观分子质量约为22 kDa（图3），比理论分子质量18.5 kDa偏大，经糖基化预测分析发现RmMan134酶蛋白分子存在1 个N-糖基化位点（NKSG）。

图3 重组甘露聚糖酶RmMan134的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of RmMan134

2.4 重组酶RmMan134酶学特性分析

重组酶RmMan 134 的最适反应温度为50 ℃（图4A），该酶的反应温度范围较广，30～80 ℃都能够检测到该酶活力，在70 ℃反应下具有30%以上酶活力，在80 ℃时能够维持20%以上活力。

图4 温度和pH值对甘露聚糖酶RmMan134活性的影响Fig.4 Effects of pH and temperature on the activity of RmMan134

由图4B可知，重组酶RmMan134具有较广的pH值作用范围，在pH 2.0～11.0范围内都表现出一定的酶活力，该酶的最适反应pH 6.0，在酸性范围内（3.0＜pH＜7.0）酶活力较高，能够维持60%以上酶活力。随着pH值的逐渐升高，酶活力也随之降低。

分析重组酶RmMan 134 的热稳定性研究发现（图4C），在50 ℃条件下，重组酶RmMan134处理1 h后，能够维持60%以上酶活力；而60 ℃处理1 h后，酶活力损失约60%。分析其pH值耐受性发现（图4D），该酶在pH 4.0～8.0范围内处理1 h后酶活力基本维持稳定，即使在碱性条件下（7.0＜pH＜11.0）依然能够维持75%以上酶活力，而在强碱条件下，重组酶极不稳定，酶活力丧失较明显。

将重组酶RmMan134对角豆胶活性定义为100%，则对底物魔芋胶、果胶、CMC-Na和木聚糖的活力分别为114.8%、44.9%、7.2%和19.6%。以魔芋胶为底物时，设定底物质量浓度的倒数（1/[S]）为横坐标，以反应速率倒数（1/V）为纵坐标，获得双倒数曲线：Y=0.0116X+0.0175，R2=0.998，计算酶的动力学参数Vmax为57.1 μmol/（min·mg），Km为0.66 mg/mL。

2.5 重组甘露聚糖酶RmMan134对5 种果汁的影响

如表1 所示，除了杏汁和葡萄汁外，重组酶RmMan134对其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中橙汁提高的最为明显，提高了23.8%。其次苹果汁提高了11%，桃汁提高了7%左右。一般来说，果汁加工用酶可以通过有效降解果汁中的纤维素、半纤维和果胶等成分，而提高果汁的澄清度，但是水果中还存在单宁、花青素及其他多酚物质，它们会和加入的酶蛋白分子交联在一起，降低果汁的澄清度[28]。因此，果汁加工用酶的最终应用效果，往往是上述两个效果的叠加。因而，在酶解杏汁和葡萄汁时，很有可能是杏汁和葡萄汁中的单宁及多酚物质与重组酶RmMan134交联在一起，影响了果汁的澄清度。除此之外，重组甘露聚糖酶的添加使得葡萄汁出汁率提高了7%左右，而重组酶并未增加上述5 种水果的总还原糖量。

表1 重组甘露聚糖酶RmMan134对不同水果出汁率、澄清度和还原糖的影响Table 1 Effect of recombinant RmMan134 on the yield,clarity and reducing sugar concentration of various fruits

3 讨论

本研究成功从浓香大曲中筛选获得了1 株嗜热真菌HBFH10，经鉴定为Rm。目前，微孢根霉菌种在食品生产中起着重要作用，已从Rm中获得了淀粉酶[29]、植酸酶酶[30]和脂肪酶[31]等。本研究从嗜热真菌RmHBFH10中克隆得到一个新的甘露聚糖酶基因（RmMan134）。

甘露聚糖酶分为GH5、GH26、GH113和GH134家族，其中GH5家族的甘露聚糖酶主要为一些真菌来源的甘露聚糖酶，而GH26主要包括一些细菌来源的甘露聚糖酶，这两类是甘露聚糖酶报道最多的酶家族来源。有研究[10]报道了一个新甘露聚糖酶（AaManA），它属于一个全新的糖苷水解酶家族（GH113），相对于前两个家族而言，GH113家族甘露聚糖酶的分布极其有限，继而限制了该家族酶的进一步挖掘。Shimizu等[8]从Aspergillus nidulans中获得了一个新甘露聚糖酶（Man134），它的氨基酸序列、结构及催化机制与其他甘露聚糖酶家族存在明显差异，最终将其归为一个新的糖苷水解酶家族（GH134），该家族甘露聚糖酶的发现为甘露聚糖的降解找到一把全新的钥匙。GH134家族的酶氨基酸序列长度非常短，一般长度为180 aa左右[32]，远低于其他3 类家族的300～500 aa，这一特点使得只需要30%左右的氨基酸材料就可以合成出所需要的甘露聚糖酶，这一特性非常令人兴奋。在本研究中，甘露聚糖酶RmMan134除含有GH134家族的催化结构域外，还含有一个18 aa组成的信号肽序列，这使得该蛋白可以分泌到细胞之外参与糖类的代谢活动。经多条序列比对分析发现，GH134家族甘露聚糖聚糖酶N端往往含有信号肽序列特征，与GH5和GH26家族相似，这也说明该类家族也很有可能在微生物中广泛分布。

重组酶RmMan134的最适pH值为6.0，这与GH134家族其他β-甘露聚糖酶最适pH 值十分相似，如来源于A.nidulans的甘露聚糖酶最适pH值为6.0，来源于A.orzae的甘露聚糖酶最适pH值为6.0[33]，来源于Streptomycessp.NRRL B-24484的甘露聚糖酶最适pH值为5.0[34]，但是它们的pH值作用范围存在较为显著差异，如同样来源Rm的甘露聚糖酶RmMan134A的最适pH值为5.0，在pH 7.0～11.0碱性条件下往往表现出非常低的酶活力，甚至会丧失全部酶活力，而对于甘露聚糖酶RmMan134来说，依然能保持20%～70%以上酶活力，同样的差异与Streptomycessp.NRRL B-24484的甘露聚糖酶也比较明显。RmMan134更适合在中性pH值环境发挥作用，这两个同功酶的存在使得Rm对环境具有较强适应能力。RmMan134与RmMan134A具有相同的最适温度（50 ℃），而其他已报道的3 个酶的反应温度在30～40 ℃之间，再次证明嗜热真菌RmHBFH10是生产高温酶制剂的优良菌株。进一步分析发现，RmMan134较RmMan134A具有较高的酶反应温度和较好的热稳定性。在反应温度为80 ℃时，RmMan134表现出20%酶活力，而RmMan134A则丧失酶活力。且酶热稳定性能的差异依然明显，RmMan134在60 ℃条件下处理30 min依然可以维持50%左右酶活力，而RmMan134A酶活力基本消失。重组酶RmMan134是目前GH134家族反应温度最高的酶，与已报道其他家族的嗜热甘露聚糖酶反应温度还有较大差距，但随着研究的进一步深入，GH134家族来源的嗜热甘露聚糖酶应该很快会被挖掘出来。

果汁的黏度和浑浊度主要受到果胶、淀粉、纤维素和半纤维素种类和含量的影响，而不同果汁中存在差异。甘露聚糖作为一种重要的半纤维广泛存在植物果实中，依据其组成特点，可分为线性甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。甘露聚糖酶可有效的降解甘露聚糖，目前已成为果汁加工中一种新型酶制剂而被加以利用，如在胡萝卜汁[35]、奇异果汁[36]、苹果汁[37]等多种果汁的生产中起到了较好的作用效果。鉴于GH134家族甘露聚糖酶的最适底物为葡甘露聚糖，因此推测很可能是水果中甘露聚糖种类造成了重组甘露聚糖酶RmMan134A对不同果汁澄清效果的差异，其中对橙汁的澄清效果最为明显，使橙汁澄清度提高了约76%，优于来自Lactobacillus caseiHDS-01甘露聚糖酶的澄清效果[38]，相似的差异在P.acidilactici（M17）来源的甘露聚糖酶也有所体现。分析发现L.caseiHDS-01菌的甘露聚糖酶属于GH26家族，而GH26家族和GH134家族采用不同的催化机制，同时作用底物也存在差异，这很可能是造成上述差异的主要原因，而更信服的结论仍需进一步进行研究。

4 结论

本研究成功从浓香大曲中筛选出嗜热真菌RmHBFH10，并从该菌中挖掘到了1 个假使蛋白，经分析为新型GH134家族甘露聚糖酶（RmMan134）。研究发现，重组甘露聚糖酶RmMan134在pH 6.0和50 ℃下表现出了最佳活性，并且在从酸性到碱性的广泛pH值范围内具有较高活性（2.0～11.0），在宽泛pH值范围内和在50 ℃条件下具有出色的稳定性。另外，重组酶RmMan134可以有效地澄清橙汁、桃汁和苹果汁，其中可使橙汁的澄清度提高约76%。