固定化蛋白质色谱模型的建立及其在先导化合物筛选中的应用

张建丰,梁 琦,李刚刚,延保国*

1. 西安市第八医院药剂科,西安 710061; 2. 西北大学生命科学学院,西安 710069

创新药物研发是当前国际科技竞争的战略制高点之一,往往耗资巨大、耗时长久。在创新药物研发进程中,先导化合物的成药性评价对于降低药物研发风险、提升研发成功率具有重大意义。目前,先导化合物的成药性评价方法主要包括体内的吸收、分布、代谢、排泄以及毒性评价等,存在消耗时间长、样品需求大量等不足,尤其是该评价过程无法证明化合物的作用靶点及作用方式,因此,亟需开发一种准确、快速、易于操作的先导化合物的成药性评价方法。

亲和色谱[1-3]具有高通量和高重复性的特点,目前已经成功应用于药物-受体相互作用的分析,该方法的应用首先需要合成受体色谱固定相,WAINER I W等已经成功实现了多种G蛋白偶联受体(G-protein coulped receptor, GPCR)色谱固定相的制备,包括β2肾上腺素受体(β2-adrenoceptor,β2-AR)[4]、烟碱型受体[5]、阿片样受体[6]、嘌呤受体[7]及大麻素受体[8]等,但以上受体色谱固定相均用物理吸附法制备,无法耐受色谱分析过程中流动相的持续洗脱,因此其稳定性较差。

为了解决上述问题,将卤代烷烃脱卤素酶标签(halo-genated alkane dehalogenase tagged, Halo-tagged)融合至受体的非活性末端,经诱导表达获得Halo标记的GPCR可通过生物正交反应一步固定至大孔微球表面[9]。用该方法制备的受体色谱固定相具有与初始受体相当的活性,可用于药物-受体相互作用分析和中药靶向活性成分筛选。在文献基础上[10],本课题组用该方法制备了β2-AR色谱固定相并将其应用于止嗽口服液活性成分的筛选,获得了能够靶向作用于β2-AR的甘草次酸,经结构修饰,得到了先导化合物XC267,本研究用非线性色谱法,以固定化β2-AR为工具,对XC267进行了初步成药性评价,以期推动β2-AR靶向药物的开发。

1 仪器与试药

1.1 仪器

3100高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司);UPD-II-10T超纯水机(四川优普超纯科技有限公司);ZHJH-1115B超净工作台(上海智诚分析仪器制造有限公司);98-1-N电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司);SS-326高压灭菌锅(TOMY公司);103恒温培养箱(杭州艾普仪器设备有限公司);5804R冷冻离心机(美国FEI公司);ZZXT-A装柱机(大连依利特分析仪器有限公司);DYCZ-24DN电泳仪(北京六一生物科技有限公司);JY92-2超声破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试药

氨基微球(知益微球有限公司);氯化钠、酵母提取物、蛋白胨和琼脂,均购自英国Oxoid公司;β2-AR一抗购自北京索莱宝生物科技有限公司;六水琥珀酸钠、乳糖、甘油、二水柠檬酸钠、葡萄糖、六水氯化铁、磷酸氢二钠、七水硫酸镁和氯化铵,均购自天津市恒心化学试剂制造有限公司;甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特罗,均购自上海阿拉丁股份有限公司;色谱级甲醇购自美国Thermo Fisher公司;其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 β2-AR受体色谱固定相的制备

按照文献中的方法[9],首先在大肠杆菌中表达了E.coliBL21(DE3)T7/halo-tagβ2-AR质粒(pReceiver-B02)。该菌种自琼脂糖培养基、一级液体培养基孵育后,37 ℃下在自诱导培养基中培养10 h,离心使菌体沉淀,向1 g大肠杆菌细胞中加入10 mL浓度为20 mmol·L-1的PBS缓冲液,超声破碎,收集上清,用蛋白质印迹法(Western blotting)确认受体表达。将6-氯己酸通过酰化反应修饰至微球表面,通过Halo标签与微球表面氯离子的生物正交反应,将Halo标记的β2-AR一步固定至微球表面,获得β2-AR色谱固定相。经湿法装柱,即得β2-AR色谱柱,见图1。

注:1.自诱导培养基菌体细胞;2.LB培养基菌体细胞;3.细胞裂解液上清;4.细胞裂解液沉淀。

2.2 色谱实验

本研究的色谱实验均在高效液相色谱仪进行。流动相为磷酸盐(20 mmol·L-1, pH 7.4)缓冲液。检测波长:甲氧那明230 nm,沙丁胺醇276 nm,妥布特罗220 nm,XC267 254 nm。进样浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.0,2.0 mmol·L-1;进样量为5 μL;进样温度为25 ℃。

2.3 数据处理

本实验用Peakfit 4.12软件中的非线性功能处理所得数据。

3 结果与讨论

3.1 β2-AR色谱固定相的制备及表征

用自诱导培养基诱导Halo标记的β2-AR的表达,超声裂解细胞后,通过离心将混合物分为上清和沉淀,用Western blotting验证目标受体的表达情况,见图1。如图1所示,经自诱导培养基孵育,β2-AR的表达量显著提高,进一步分析可知,成功表达的受体主要存在于上清中,表明Halo标记的β2-AR溶解性良好。

通过观察甲氧那明、沙丁胺醇、妥布特罗的甲醇溶液在β2-AR色谱柱上的保留行为考察该色谱系统的特异性,按照2.2项下条件进样检测,见图2。由图2可知,甲氧那明、沙丁胺醇、妥布特罗在β2-AR色谱柱上的保留时间分别为4.5 、4.9 、7.1 min,远长于该色谱系统的死时间,且各药物保留时间差异较大,表明固定化β2-AR色谱柱可以通过保留时间的差异来识别其配体,具有特异性。

注:黑线.甲氧那明;蓝线.沙丁胺醇;红线.妥布特罗。

3.2 3种药物与固定化β2-AR的相互作用分析

非线性色谱法是一种非理想条件下的色谱系统方程,适用于亲和色谱结合速率常数的测定,该理论是基于以下2个假设:(1)假设色散和柱外效应可忽略,(2)假设吸附和解离的动力学速率是色谱峰展宽的主要原因。其方程如下[11]。

(1)

(2)

y表示归一化的信号强度,x是调整保留时间,I0( )和I1( )是调整贝尔塞函数,a0为峰面积参数,a1为动力学容量因子参数,a2为峰展宽参数,a3为峰变形参数。根据该方程可求得配体与受体的解离速率常数Kd以及平衡常数KA,计算公式为Kd=1/(a3t0);KA=a3/C0。

由上述方程可知,非线性色谱法不仅能准确测定结合常数,而且能同步获得受体与配体的解离速率参数,为受体-药物相互作用参数的全面测定提供了借鉴。此外,与前沿分析法、竞争置换法等方法相比,该方法无需用大量配体饱和色谱柱,有效弥补了分析时间长和药物用量大的不足。

将上述3种配体在不同浓度下的色谱参数导出为excel文件,其中,X为保留时间,Y为紫外吸收强度,t0为死时间,C0为进样脉冲宽度与溶质的浓度的乘积,其中进样脉冲宽度为定量环体积与色谱系统死体积的比值,按照x=X/t0,y=Y/C0进行归一化处理即得上述方程中的x和y。将x和y导入Peak fit4.11,用最小二乘法对所得色谱峰进行去基线处理,对色谱峰进行拟合,可得到非线性有关参数,见图3。

图3 沙丁胺醇在β2-AR色谱柱上的非线性色谱拟合图

用非线性色谱法进行药物-受体相互作用分析,在色谱柱不饱和时,a1和a2并不随着进样浓度的改变而改变。3种药物在6种进样浓度下的参数见表1。由表1可知,3种药物对应的浓度范围为甲氧那明0.05～0.20 mmol·L-1,沙丁胺醇0.10～0.50 mmol·L-1,妥布特罗0.10～0.20 mmol·L-1,通过3种配体对应的浓度范围内a2和a3,即可求得3种药物与β2-AR的结合常数和解离速率常数,见表2。甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特罗与β2-AR的结合常数分别为4.9×103、9.9×103、2.0×104L·mol-1。与文献报道的结合常数相比,虽然3种药物的结合常数低一个数量级,这可能是由于受体的来源不同导致的,但3种药物的结合常数的大小排序与文献报道一致[12],妥布特罗与β2-AR的结合常数最大,表明妥布特罗与受体的结合力最强。同时,甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特罗与β2-AR的解离速率常数为8.1、13.8、5.7 s-1,其中,甲氧那明与妥布特罗具有相当的解离速率常数,表明这2种药物与受体结合后解离速度更慢,作用更久,与文献报道一致[13]。以上结果证明固定化β2-AR可用于药物-受体相互作用的分析。

表1 非线性色谱法测定甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特罗在不同浓度下的参数

表2 非线性法测定甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特罗与β2-AR的相互作用参数

3.3 先导化合物与固定化β2-AR的相互作用分析

前期研究发现了具有潜在抗哮喘作用的甘草次酸衍生物XC267,结构式见图4,用本文所建立的固定化β2-AR模型评价该化合物的成药性,结果与阳性药一致,分别按照0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mmol·L-1的浓度将XC267进样到β2-AR色谱柱,按照公式(1)处理后,XC267的非线性色谱参数见表3,计算得XC267与β2-AR的结合常数为4.4×103L·mol-1,解离速率常数为8.7 s-1,虽然远小于妥布特罗,但该化合物与甲氧那明具有相当的结合常数与解离速率常数,表明该化合物能特异性作用于β2-AR,成药性良好。

表3 非线性色谱法测定XC267在不同浓度下的参数

图4 化合物XC267的结构

4 结论

通过生物正交法将β2-AR一步固定至大孔微球表面,成功制备固定化β2-AR色谱模型,用非线性色谱法测定了甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特罗作用于β2-AR的结合常数和解离速率常数,证明该色谱模型可用于先导化合物的筛选和评价。进一步用该模型对XC267的成药性进行评价,证实XC267具有与甲氧那明相当的结合常数和解离速率常数,是一种潜在的β2-AR特异性激动剂。本研究亦为先导化合物的成药性评价提供了方法学借鉴。