白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量分析及风险评价

李 立,罗 轶*,李丽莉*,蒋 湘,黄燕红

1．广西壮族自治区食品药品检验所,国家药品监督管理局中药材质量监测与评价重点实验室,南宁 530021;2．广西-东盟食品检验检测中心,南宁 530021

白背三七Gynuradivaricata(L.) DC.为菊科三七草属植物白子菜的全草,又名金鸡毛草、白子菜、鸡毛菜等,具有清热、活血、止血的功效,主治咳嗽、疮疡、烫火伤、跌打损伤、风湿痛、崩漏及外伤出血[1]。白背三七是广西常见的壮瑶药之一,可用于各种炎症的治疗,民间广泛应用于高血脂症、胃病、糖尿病和高血压的治疗[2]。近年来,学者从白背三七中分离得到了黄酮类、三萜类、甾醇类、核苷类、生物碱类等化学成分[3-6]。李丽梅等[7]用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技术检测出白背三七中含有全缘千里光碱。吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloids, PAs)及其氮氧化物(pyrrolizidine alkaloidN-oxides, PANOs)的分子结构是1,2位具有双键的双稠吡咯啶环,其不饱和双键结构是PAs及PANOs产生毒性的前提,摄入过多或过久都会导致不可逆的肝损伤,严重者会出现肝硬化及肝纤维化[8-15]。2020年欧盟发布关于食品中PAs的含量规定,草药的最高限量规定为200 μg·kg-1,该规定适用于草药及所有食品原料,于2022年7月1日正式实施[16]。因此对中草药的PAs及PANOs进行检测具有重要意义。

目前已在菊科植物中检测到倒千里光碱、千里光菲灵碱和千里光宁碱等PAs及PANOs[17-18]。白背三七是菊科植物,但未有文献报道白背三七中含有PAs及PANOs。本文根据文献报道菊科植物中存在的PAs及PANOs,用超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatograph tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)对白背三七中的芝麻菜叶千里光碱-N-氧化物、春千里光碱、野百合碱、春千里光碱-N-氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱和千里光宁碱进行筛查,其分子结构见图1,根据筛查结果初步对其进行风险评价。

注:1. 芝麻菜叶千里光碱-N-氧化物;2. 春千里光碱;3. 春千里光碱-N-氧化物;4. 倒千里光碱;5. 千里光菲灵碱;6. 千里光宁碱;7. 野百合碱。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Exion LC超高效液相色谱-联用TRIPLE QUAD 6500+三重四极杆质谱仪(美国AB SCIEX);XS205DU十万分之一电子天平(梅特勒-托利多有限公司);MCX混合型阳离子交换固相萃取小柱(美国沃特斯有限公司)。

1.2 试药

对照品:芝麻菜叶千里光碱-N-氧化物(批号12642,质量分数>98%)、春千里光碱(批号14139,质量分数>98%)和春千里光碱-N-氧化物(批号14845,质量分数>98%),均购自PhytoLab GmbH公司;倒千里光碱(批号PF190423-03,质量分数>98%)、野百合碱(批号RF190526-08,质量分数>98%)和千里光宁碱(批号PF190717-06,质量分数>98%),均购自Stanford Chemicals公司;千里光菲灵碱(批号DST1908125,质量分数>98%,成都德思特生物技术有限公司)。

白背三七样品共5批(编号为S1～S5),分别采自广西壮族自治区东兴市、钦州市、北海市、防城港市及柳州市,经广西壮族自治区食品药品检验所黄清泉主管中药师鉴定为白背三七的全草。

2 方法和结果

2.1 溶液的制备

2.1.1混合对照品溶液 精密称定野百合碱、芝麻菜叶千里光碱-N-氧化物、春千里光碱、春千里光碱-N-氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱对照品适量,分别加甲醇配成质量浓度为10.256、10.368、10.154、9.985、10.280、9.887、10.065 μg·mL-1的对照品储备液。精密吸取各对照品储备液1.0 mL,置于同一20 mL量瓶中,加入体积分数为50%的甲醇稀释至刻度,得到7种成分质量浓度分别为0.512 8、0.518 4、0.507 7、0.499 2、0.514 0、0.494 4、0.503 2 μg·mL-1的混合对照品溶液,备用。

2.1.2供试品溶液 精密称取白背三七粉末(过4号筛)2.0 g,置于具塞锥形瓶中,加入0.05 mol·L-1硫酸溶液20 mL,超声(320 W,40 kHz)提取30 min,过滤,取续滤液10 mL,过SPE-MCX固相萃取小柱,先用甲醇10 mL淋洗, 再用体积分数为5%的氨水-甲醇溶液10 mL洗脱,最后收集洗脱液,浓缩至1 mL,用体积分数为50%的甲醇定容至20 mL,即得。

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-C18(150 mm×3.0 mm,2.7 μm);柱温为40℃。流动相:A为1 mL·L-1甲酸与5.0 mmol·L-1甲酸铵水溶液,B为1 mL·L-1甲酸的甲醇,梯度洗脱:0～12 min,5%～30% B;12～13 min,30%～90% B;13～16 min,90% B;流速为0.3 mL·min-1。进样量为2 μL。

2.3 质谱条件

用电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)离子源,正离子,质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式,气帘气(urtain gas,CUR)流速为20 L·min-1,喷雾电压(ionspray voltage,IS)为5 500 V,离子源温度(temperature,TEM)为450 ℃,质谱条件见表1,对照品及供试品色谱图见图2、图3。

表1 目标成分的质谱参数

注:1.芝麻菜叶千里光碱-N-氧化物;2.春千里光碱;3.春千里光碱-N-氧化物;4.倒千里光碱;5.千里光菲灵碱;6.千里光宁碱;7.野百合碱。

注:4. 倒千里光碱。

2.4 方法学考察

2.4.1线性关系、检测限(limited of detection,LOD)和定量限(limited of quantification,LOQ) 精密吸取混合对照品溶液0.05、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL,置于10 mL量瓶中,加入体积分数为50%的甲醇定容至刻度,摇匀,得到系列质量浓度的混合对照品溶液,按照2.2项下色谱条件进行检测。以对照品峰面积y作为纵坐标,以相应质量浓度x作为横坐标,进行线性回归。以定量离子的色谱峰信噪比(S/N≥3)对应的最小质量浓度为LOD,以定量离子色谱峰信噪比(S/N≥10)对应的最小质量浓度为LOQ,结果见表2。

表2 7个化合物的线性方程、线性范围、检测限和定量限

2.4.2精密度 精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液2 μL,连续进样6次并记录峰面积。计算得各对照品峰面积的RSD值(n=6)为1.62%～2.54%,表明该仪器的精密度良好。

2.4.3重复性 取S1号供试品溶液6份,分别加5.0 mL混合对照品溶液,按照2.1.2项下方法制备,进样测定。计算得各对照品含量的RSD值为2.25%～3.51%,表明该方法的重复性良好。

2.4.4稳定性 取S1号供试品溶液,分别在0、4、8、12、24 h进样检测。计算得各对照品峰面积的RSD值(n=6)为1.30%～2.62%,表明供试品在24 h内稳定。

2.4.5回收率 取S4号供试品6份,每份约1.0 g,精密称定,分别置于具塞锥形瓶中,精密加入2.1.1项下的混合对照溶液1.0 mL,按照2.1.2项下方法制备供试品溶液,按照2.2项下色谱条件测定,计算回收率。计算得芝麻菜叶千里光碱-N-氧化物、春千里光碱、春千里光碱-N-氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱、野百合碱的平均加样回收率分别为90.20%、88.62%、91.44%、89.75%、92.16%、90.89%、 89.31%,RSD值分别为2.02%、2.55%、3.12%、2.61%、2.76%、3.48%、2.98%。

2.5 含量测定

取不同产地白背三七2.0 g,精密称定,按照2.1.2项下方法制备供试品溶液,按照2.2和2.3项下条件进样检测,用外标法计算芝麻菜叶千里光碱-N-氧化物、春千里光碱、春千里光碱-N-氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱、野百合碱的含量,结果显示5批样品中均检出倒千里光碱,其余成分尚未检出。结果见表3。

表3 样品的含量测定结果(其中 S1:n=6;S2～S5:n=2)

3 含量测定结果分析及风险评价

3.1 含量测定结果分析

5批白背三七中均检出倒千里光碱,其含量为158.76～1 714.89 μg·kg-1。从产地分析,广西柳州市的白背三七中倒千里光碱的含量最高,但由于批次较少,产地与吡咯里西啶含量之间存在的规律需要采集不同产地多批次药材加以比较分析得出。

3.2 风险评价

该研究所测5批白背三七样品中吡咯里西啶生物碱的含量为158.76～1 714.89 μg·kg-1,按照《中药大辞典》[1]规定白背三七用量以6～15 g计,日摄入量为0.95～25.72 μg。目前我国无该药材的PAs限值规定。欧洲药品监管局(EMA)于2016年针对含有吡咯里西啶生物碱的草药污染问题发表公开声明[19],草药委员会建议每日PAs的摄入量在0.35 μg以下,5批白背三七中PAs的含量均远远超过欧盟的标准规定。

当前国际权威机构在进行吡咯里西啶生物碱风险评价时,均以暴露限值(margin of exposure,MOE)为标准。如果MOE>10 000,则健康风险小;反之,则大。白背三七中PAs的MOE用公式(1)、公式(2)进行计算,结果见表4。

表4 白背三七中吡咯里西啶生物碱的风险评估结果

EDI=C×M/(BW×1 000)

(1)

MOE=BMDL10/EDI

(2)

式中,EDI为估计每日摄入量(μg·kg-1·d-1);C为药材中含有PAs的总量(μg·kg-1);M为药材的最大使用剂量,白背三七为15 g;BW为人体体质量,以70 kg计;1 000为换算因子。BMDL10是PAs健康指导值,为237 μg·kg-1·d-1[20]。

5批白背三七的MOE均小于10 000,若长期使用,存在用药风险。因此,药材标准中有必要增加PAs的限量规定和服用风险提示,以降低用药风险,确保用药安全。

4 讨论

4.1 色谱柱的选择

本研究考察了Agilent Poroshell 120 SB-C18(150 mm×3.0 mm,2.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、Thermo Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)3种不同型号的色谱柱对相同质量浓度的对照品溶液进行分析,考察其分离效果与保留时间。用Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱时春千里光碱和千里光宁碱色谱峰无法分开,用Thermo Hypersil GOLD柱时色谱峰的峰形不够尖锐,用Agilent Poroshell 120 SB-C18柱时分离效果最好,能使春千里光碱和千里光宁碱这对同分异构体达到基线分离,且峰形更尖锐且对称,响应值高,因此用Agilent Poroshell 120 SB-C18作为本研究的色谱柱。

4.2 流动相的选择

本研究分别考察了甲醇-水,乙腈-水,1 mL·L-1甲酸-乙腈,1 mL·L-1甲酸乙腈-5.0 mmol·L-1甲酸铵,1 mL·L-1甲酸甲醇-5.0 mmol·L-1甲酸铵(含1 mL·L-1甲酸)等流动相对待测化合物的影响。结果发现,1 mL·L-1甲酸甲醇能使基线噪音较低,有效改善峰形,含1 mL·L-1甲酸和5.0 mmol·L-1甲酸铵的水溶液能提高化合物的响应值和离子化的效率。因此选择1 mL·L-1甲酸甲醇作为有机相,1 mL·L-1甲酸和5.0 mmol·L-1甲酸铵的水溶液作为水相。

4.3 质谱条件的优化

将1 μg·mL-1的混合对照品溶液在正、负离子模式下进行全扫描,7种化合物在正离子模式下均能得到很好的加氢峰,响应强度较好。优化去簇电压使母离子的相应丰度最大且稳定,同时优化碰撞能量,选择响应丰度较高、出峰稳定、无干扰的2～3个碎片离子作为子离子,其中响应最高的作为定量离子。

4.4 样品前处理方法的选择

4.4.1提取溶剂的选择 PAs提取一般用极性较大的溶剂,如甲醇[21]或水[22]等,加入少量的酸,可以提高PAs的水溶性[23-24]。本研究考察了甲醇、甲醇-水、0.05 mol·L-1硫酸水等作为提取溶剂时的提取效率。结果发现不加酸提取,所有PAs用水提取的回收率均低于用甲醇提取的回收率;用0.05 mol·L-1硫酸水提取的回收率均高于用甲醇提取的回收率。因此确定提取溶剂为0.05 mol·L-1硫酸水。可能是因为PAs为碱性化合物,在酸性环境中以离子形式存在,增强水溶性,导致酸水提取效率比甲醇高。

4.4.2固相萃取小柱的选择 固相萃取、液-液萃取等方式可以减少背景干扰,提高结果的准确性。本实验考察了C18-SPE、Waters Oasis HLB、聚合物阳离子小柱(HyperSep Retain-CX)、混合型弱阳离子固相萃取小柱(PCX)和混合型阳离子固相萃取小柱(MCX)5种类型的小柱,见图4。由图4可知,用C18-SPE和HyperSep Retain-CX小柱对7种成分进行净化,效果不理想;野百合碱、千里光菲灵碱、春千里光碱-N-氧化物在用HLB小柱萃取时回收率均低于70%;PCX对千里光菲灵碱、千里光宁碱和春千里光碱的保留较差,回收率也低于70%;而MCX对7种成分具有较高的选择性,回收率均大于80%,均获得了很好的净化效果。因此选择MCX固相萃取小柱进行样品的提取净化。

图4 7种吡咯里西啶生物碱过不同萃取小柱的回收率

4.4.3洗脱溶剂的优化 因被测成分均为生物碱类成分,在碱性条件下容易被洗脱,因此选用氨化甲醇作为洗脱溶剂。考察了2%、5%、10% 3种不同体积分数的氨化甲醇和5、10、15 mL 3种不同体积氨化甲醇对被测成分的影响,综合考虑被测成分的洗脱效果等因素,最后选择10 mL 体积分数为5%的氨化甲醇作为洗脱溶剂,能达到最佳的洗脱效果。

5 小结

本研究建立的UPLC-MS/MS专属性强,可在20 min内快速分析芝麻菜叶千里光碱-N-氧化物、春千里光碱、春千里光碱-N-氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱和野百合碱7个PAs及PANOs的含量。本研究结果显示,5批白背三七中均含有倒千里光碱,风险评估结果显示白背三七存在一定的用药风险。民间常用白背三七治疗胃病、高血压、高血脂症及糖尿病等,因此有必要建立白背三七中PAs的检测方法并加强对白背三七中PAs含量的监管。