基于高效液相色谱指纹图谱及化学计量学的半枝莲质量分析

窦锦明,常跃兴,荆汉卫,张天欣,王振华*

1. 潍坊市中医院药学部,潍坊 261041; 2. 安徽理工大学医学院,淮南 232063;3. 潍坊市检验检测中心,潍坊 261061;4. 山东中医药大学,济南 250355

半枝莲为唇形科植物半枝莲ScutellariabarbataD. Don的干燥全草,味辛、苦,性寒,归肺、肝、肾经,具有清热解毒、化瘀利尿的功效。用于疔疮肿毒、咽喉肿痛、跌扑伤痛、水肿、黄疸和蛇虫咬伤的治疗。现代药理研究结果表明,其具有解热、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、利尿、抑菌及抗病毒等作用,常用于治疗疔疮、肺痈、急性肾炎和癌症[1-2]。

目前,大多数学者对半枝莲所含的化学成分已达成共识,其主要含有黄酮类、二萜类、生物碱、香豆素、多糖和甾醇等成分[3-4],但半枝莲质量评价的方法不尽相同。有学者以黄酮、总黄酮含量评价半枝莲质量[5-6],有学者以萜类评价半枝莲质量[7-8],均无法全面反映半枝莲所含的化学成分。本文收集不同产地的12批半枝莲,用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)指纹图谱[9-11]结合化学计量学[12]技术建立半枝莲的质量控制方法,旨在为半枝莲的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT(SPD-M20A检测器)高效液相色谱仪、AUW120D型分析天平均购自岛津制作所;KQ-250型超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

1.2 试药

木犀草苷(批号111720-202111)、野黄芩苷(批号110842-202010)、芹菜素(批号111901-202004),木犀草素(批号111520-202107)、半枝莲对照药材(批号121293-202105),均购自中国食品药品检定研究院;12批[S1(对照药材)、S2(广西玉林)、S3(广西南宁)、S4(广西柳州)、S5(广东梅州)、S6(广东清远)、S7(广东揭阳)、S8(云南昆明)、S9(云南普洱)、S10(云南大理)、S11(河南驻马店)、S12(河南平顶山)、S13(河南南阳)]半枝莲经潍坊市检验检测中心荆汉卫主任中药师鉴定为唇形科半枝莲ScutellariabarbataD. Don的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为InertSustain C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)梯度洗脱(0～15 min,15%～18% A;15～30 min,18% A;30～45 min,18%～25% A;45～60 min,28%～38% A;60～65 min,38%～90% A;65～70 min,90% A。梯度流速0～15 min,1.0 mL·min-1;15～30 min,0.8 mL·min-1;30～70 min,1.0 mL·min-1。进样量为10 μL,检测波长为335 nm,柱温为30 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1对照品溶液 分别精密称取木犀草苷、野黄芩苷、木犀草素、芹菜素对照品适量,置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,得对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 精密称取12批半枝莲样品粉末(过3号筛)约1.0 g,置于具塞三角瓶中,加体积分数50%甲醇50 mL,称定质量,超声处理40 min,放冷,再称定质量,用体积分数为50%的甲醇补足减失的质量,摇匀,经0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,得供试品溶液。

2.2.3对照药材溶液 精密称取半枝莲对照药材粉末(过3号筛)约1.0 g,按照2.2.2项下方法制备。

2.3 方法学考察

2.3.1精密度实验 取2.2.3项下制备的对照药材溶液,按照2.1项下的色谱条件进样6次,得共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于1.0%,表明仪器的精密度良好。

2.3.2稳定性实验 取对照药材溶液,按照2.1项下色谱条件于0、2、4、8、12、24 h进样,得共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于1.0%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3重复性实验 取6份对照药材粉末,按照2.2.2项下的方法制备,按照2.1项下色谱条件进样,得共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于1.0%,表明该方法的重复性良好。

2.4 HPLC指纹图谱的建立

取12个批次半枝莲供试品溶液,按照2.1项下的色谱条件测定。将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012年版”分析,以S1对照药材的色谱图为参照图谱,生成半枝莲HPLC指纹图谱,见图1。

注:紫外吸收光谱图:波长190～400 nm;黑线为对照药材光谱;红线为对照品光谱。

12批半枝莲样品的相似度为0.994～0.972,表明不同产地半枝莲化学成分的种类相似。标定共有色谱峰30个,与对照品色谱图(保留时间)、紫外吸收光谱(特征吸收峰)比对,确认4个色谱峰,11号峰为木犀草苷,12号峰为野黄芩苷(参照峰),23号峰为木犀草素,28号峰为芹菜素。半枝莲HPLC指纹图谱共有峰的保留时间差别较小,但峰面积差异较大,表明不同产地半枝莲化学成分的种类相近,但含量有差异。

2.5 化学计量学分析

2.5.1聚类分析(cluster analysis,CA) 将半枝莲各批次共有峰面积Z-Score标准化,导入MetaboAnalyst 5.0软件进行K-means聚类分析[13]和Ward聚类分析[14](组间连接,欧式平方距离),见图2、图3。由图2、图3可知,河南为一类,云南为一类,广东、广西为一类,表明各产地半枝莲的化学成分含量有显著差异。

图2 不同产地半枝莲K-means聚类分析

图3 不同产地半枝莲Ward聚类分析热图

2.5.2主成分分析(principle component analysis,PCA) 将半枝莲各批次共有峰面积Z-Score标准化,导入SPSS 26和MetaboAnalyst 5.0软件进行PCA分析[15],得到3个主成分(特征值>1),其方差贡献率为PC1(42.70%)、PC2(27.00%)、PC3(12.30%),累积方差贡献率为82.00%,表明3个主成分代表原始色谱峰的大部分信息。

PCA得分见图4。由图4可知,河南为一类,云南为一类,广东、广西为一类,与聚类分析结果一致,表明各产地半枝莲的化学成分含量有显著差异。将3个主成分矩阵结果(得分>0.800)求并集后,显示有差异的色谱峰为1、10、12、14、15、16、18、19、11、22号峰。见图5。

图4 不同产地半枝莲主成分分析得分图

图5 不同产地半枝莲主成分分析的成分矩阵得分图

2.5.3偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA) 将半枝莲各批次共有峰面积Z-Score标准化,导入MetaboAnalyst 5.0软件进行PLS-DA分析[16],置换检验法(1 000次)显示P=0.017,LOOCV交叉验证显示累积R2=0.971 5,Q2=0.639 65,Accuracy=0.916 67,表明可靠度高。

PLS-DA得分图见图6。由图6可知,河南为一类,云南为一类,广东、广西为一类,与聚类分析结果一致,表明各产地半枝莲的化学成分含量有显著差异。将3个Components VIP得分结果(VIP 值>1.0)求并集后,结果显示有差异的色谱峰为1、2、3、6、8、10、11、12、13、14、16、18、19、28号峰。见图7。

图6 不同产地半枝莲偏最小二乘法判别分析得分图

图7 不同产地半枝莲偏最小二乘法判别分析VIP得分图

2.5.4质量标志物鉴别 对PCA的成分矩阵和PLS-DA的VIP值分析结果取交集,获得差异化学成分为1、10、11、12、14、16、18、19号峰。半枝莲的可能药效部位为黄酮类成分,10、11、12、14、16、18、19号峰均在250～280 nm和310～350 nm范围内有强吸收,符合黄酮类成分的特征紫外吸收带。各色谱峰标准化峰面积箱线图见图8。结果显示不同产地化学成分含量有显著性差异,因此,确定10、11(木犀草苷)、12(野黄芩苷)、14、16、18、19号峰为潜在质量标志物[17]。河南、广西、云南产地各质量标志物含量波动小于广东产地,表明河南、广西、云南产地半枝莲质量稳定性高于广东。河南产地各质量标志物含量高于广东、广西、云南,表明河南产地半枝莲质量优于广东、广西、云南。

注:纵坐标为峰面积标准化值;横坐标为产地信息。A.10号峰(保留时间19.635 min);B.11号峰(保留时间20.889 min);C.12号峰(保留时间22.067 min);D.14号峰(保留时间25.265 min);E.16号峰(保留时间30.901 min);F.18号峰(保留时间39.937 min);G.19号峰(保留时间40.769 min)。

3 讨论

考察提取溶剂(水,体积分数25%、50%、75%、100%甲醇)和提取时间(20、40、60 min)发现,体积分数50%甲醇超声40 min提取的色谱峰信息量丰富。考察色谱系统(甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液)显示,乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液分离效果最佳。用PDA检测器对各色谱峰在190～400 nm波长范围内扫描,显示335 nm处色谱峰基线平稳,色谱峰信息量丰富。

本研究建立了半枝莲HPLC指纹图谱联合化学计量学的质量分析方法,结果显示,不同产地半枝莲指纹图谱相似度均大于0.900,相对峰面积有差异,表明不同产地半枝莲所含的化学成分种类一致性高,但化学成分含量有差异。K-means和Ward聚类分析、PCA和PLS-DA均显示不同产地半枝莲分3类。质量标志物鉴别显示各产地半枝莲化学成分的含量有差异,能分辨各产地半枝莲质量的优劣和稳定性,可作为半枝莲质量标志物的考察指标。分析原因,可能与不同产区的气候、纬度、海拔、土壤和药材采收原则等有关[18-20],有待进一步研究。

半枝莲HPLC指纹图谱加化学计量学的质量评价方法能全面反映不同产地半枝莲的化学成分信息,为半枝莲饮片的质量标准研究和含半枝莲的中成药质量标准研究提供依据。