无菌体液标本中碳青霉烯类异质性耐药铜绿假单胞菌的危险因素分析

赖汉瑜,岑丽莲

肇庆市第一人民医院检验科,广东肇庆 526060

铜绿假单胞菌(Pae)是引起医院内感染的主要条件致病菌,可引起人体多部位感染,如消化道、呼吸道、泌尿道、肺部、心脏瓣膜和手术部位感染,甚至还能引起血流感染[1-4]。Pae易对多种抗生素产生耐药性,因此临床治疗Pae感染一直具有挑战性[3]。亚胺培南(IPM)和美罗培南(MEM)等碳青霉烯类药物已被广泛用于治疗严重感染,且对Pae表现出较强的活性[3]。有研究表明,异质性耐药(HR)的出现可能会降低碳青霉烯类的有效性[4]。HR定义为在同一培养皿中存在具有更高抗生素耐药性水平的亚株[5]。HR分离株通过常规药敏试验确定为敏感菌,当患者连续大剂量暴露于抗生素后,高水平耐药亚群发展为优势菌,最终导致治疗失败,甚至反复感染[6]。目前,国内外仅有少量关于描述碳青霉烯HR Pae(CHPA)分离株发病率的流行率数据,这些数据可能准确地呈现了临床环境中HR的动态变化。本研究分析了临床送检无菌体液中分离的Pae中CHPA的检出情况,以期为感染控制和指导临床合理用药提供参考依据,现报道如下。

1 材料与方法

1.1一般资料 (1)菌株来源:选取2020年1月至2021年12月本院临床送检无菌体液中非重复培养标本,剔除同一患者同一部位重复分离的菌株,分离出首次非重复Pae 139株作为研究标本。所有菌株均由Vitek2 Compact全自动微生物鉴定系统进行常规抗菌药物敏感性测试。(2)患者临床资料:收集患者的基本信息与临床资料,如性别、年龄、入住科室、是否接受侵入性医疗操作(包括手术、气管插管、胃管、尿管、引流管和胃肠镜检查等)及分离后是否持续或反复发生细菌感染。记录菌株分离前、后1天内的常规生化项目,包括钾(K)、钠(Na)、氯(Cl)、钙(Ca)、二氧化碳结合力(CO2CP)、肌酐(Cr)、血糖(Glu)、尿素氮(BUN),以及分离前、后1 d内的白细胞计数(WBC)、中性粒细胞计数(NEUT)、淋巴细胞计数(LYMPH)等。所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会审核批准。

1.2试剂 血平板、微生物培养基(MH平板)均购自梅里埃(上海)生物制品有限公司;MEM和IPM药敏纸片(10 μg/片)均购自英国Oxoid公司;MEM和IPM干粉均购自美国Apexbio公司。采用标准菌株CHPA ATCC27853进行质量控制,标准菌株由国家卫生健康委员会临床检验中心提供。

1.3方法

1.3.1K-B纸片扩散法 所有操作均按照《临床检验操作规程》第4版[7]进行。药敏试验结果参照美国临床和实验室标准协会指南(CLSI)2020年版标准判定。结果判读时观察抑菌圈内是否有菌落生长,根据生长情况将菌株分为3类:(1)HR为抑菌圈内有细菌生长;(2)非HR为抑菌圈内无细菌生长;(3)完全耐药为没有抑菌圈。

1.3.2群体谱分析(PAP)实验 PAP实验是确认HR表型的金标准[5]。配制 0.25～32 μg/mL共8个质量浓度梯度且含抗菌药物的MH平板。菌株复苏后接种于血平板37 ℃培养16～18 h后,挑取单个菌落接种于MH肉汤,37 ℃培养过夜以增菌,取50 μL菌液均匀涂布于配置好抗菌药物的平板上,37 ℃培养24 h后进行菌落计数。对照菌株由国家卫生健康委员会临床检验中心提供,为非HR的CHPA ATCC27853和完全耐药的p2020(本实验室分离的菌株)。

2 结 果

2.1CHPA检出情况

2.1.1K-B法初筛 139株临床分离的Pae中初筛结果提示存在碳青霉烯HR,主要表现为碳青霉烯类药物药敏试验纸片的抑菌圈内出现了分散菌落。见图1。

图1 分离株对碳青霉烯HR的现象(K-B 法)

2.1.2确证试验 使用PAP对初筛HR阳性的标本进行确证试验。HR菌株的PAP曲线随抗菌药物浓度升高而降低,并在抗菌药物浓度高于最低抑菌浓度的平板上仍可生长。非HR的CHPA ATCC27853 表现为在最低抑菌浓度附近菌落数急剧下降至无菌生长。经PAP确认,139株临床分离株中有61株为CHPA菌株,HR率为43.88%。其中对IPM-HR检出29株,HR率为20.86%;MEM-HR检出19株,HR率为13.67%。同时对 MEM 和 IPM 均表现为HR的CHPA有13株,占9.35 %。见表1、图2。

表1 CHPA检出结果[n(%),n=139]

图2 分离株对碳青霉烯HR的PAP 分析

2.23种分离株的临床特征情况比较 将确证试验中的3种分离株分别进行比较,将只对IPM产生HR、对 MEM 和 IPM 均产生HR的菌株作为IPM-HR分离株(42株),其余作为IPM-非HR分离株(97株)。将只对MEM产生HR、对MEM和IPM 均产生HR的菌株作为MEM-HR分离株(32株),其余作为MEM-非HR分离株(107株)。将对IPM和(或)MEM产生HR的菌株作为CHPA-HR分离株(61株),其余对两种药物都不产生HR的作为CHPA-非HR分离株(78株)。与IPM-非HR比较,IPM-HR男性、老年、侵入治疗手段、多次感染比例及CO2CP测量值均更高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与MEM-非HR比较,MEM-HR 侵入治疗手段、多次感染比例均更高,WBC、BUN、Cr测量值均更低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与CHPA-非HR比较,CHPA-HR男性、侵入治疗手段、多次感染比例及CO2CP测量值均更高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3种分离株的临床特征情况比较

2.3多因素Logistic回归分析 将上述表2中差异有统计学意义的指标进行多因素Logistic回归分析患者感染CHPA菌株的危险因素。因变量为分离株的HR情况,自变量为侵入治疗手段、多次感染、老年、男性、WBC、CO2CP、BUN、Cr。其中,WBC、CO2CP、BUN、Cr以实际测量值赋值,其余变量赋值见表3。多因素Logistic回归分析结果显示,侵入治疗手段(OR=5.165,95%CI:1.158～23.033,P=0.031)、多次感染(OR=13.203,95%CI:3.698～47.136,P<0.001)、老年(OR=3.258,95%CI:1.054～10.076,P=0.040)和男性(OR=47.793,95%CI:4.406～518.371,P=0.001)是IPM-HR感染的独立危险因素;而WBC升高(OR=0.848,95%CI:0.740～0.973,P=0.018)是IPM-HR感染的保护因素。多次感染(OR=3.582,95%CI:1.284～9.999,P=0.015)是MEM-HR感染的独立危险因素。侵入治疗手段(OR=16.046,95%CI:4.231～60.853,P<0.001)、多次感染(OR=14.700,95%CI:5.279～40.938,P<0.001)和男性(OR=3.312,95%CI:1.074～10.215,P=0.037)是CHPA感染的独立危险因素;而WBC升高(OR=0.891,95%CI:0.798～0.995,P=0.041)是CHPA感染的保护因素。

表3 变量赋值

3 讨 论

有研究表明,HR发生率涉及杀菌类抗生素,包括β-内酰胺类、糖肽类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和作用于厌氧菌的硝基咪唑抗生素,且对革兰阳性菌的HR相对多见,对于革兰阴性菌HR的文献报道多集中在Pae、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌等临床常见致病菌[8-9]。HR中更具耐药性的亚群在无抗生素培养基中连续传5～10代后,一部分可恢复到母菌的耐药水平且同时保留HR的特性,而其他亚群则保持其高水平的抗性[10]。这些亚群难以被传统微生物药敏试验检出,可能对细菌耐药检测产生很大影响,甚至影响患者预后。因此需要了解细菌HR的现状。研究CHPA的流行情况、感染的危险因素及临床意义对耐药性监测和评估患者的预后至关重要。

本研究经PAP确认,139株临床分离株中61株为 CHPA 菌株,HR率为43.88%。据文献报道,无菌体液标本中CHPA分离株在中国西南部的检出率可达80%以上,而广东地区则在30%左右[11]。此外,本研究观察到具有IPM-HR的CHPA分离株比MEM-HR更常见,这与其他地区的文献报道结果不一致,可能与不同地区使用碳青霉烯治疗严重感染的用药习惯不同及碳青霉烯药物处方增加造成的选择压力有关。

本研究大部分CHPA主要来源于重症医学科,可能是这些病区的患者基本都接受了侵入性治疗并有留置管,而CHPA则是引起导管相关性细菌感染最主要的细菌之一[12]。侵入治疗手段(OR=16.046,95%CI:4.231～60.853,P<0.001)是CHPA感染的独立危险因素,也是CHPA发生的主要危险因素。侵入性操作对患者造成不同程度的损伤,人体的正常屏障受到破坏,长期置管使得CHPA更容易感染这部分患者。有创性操作的插管内壁上可检出生物膜,而CHPA极易形成生物膜[13]。生物膜的特性表现出协同效应,延缓了抗菌剂的渗透,降低了微生物的生长速率,促进菌株中具有不同水平耐药性亚群的出现[14]。另有研究表明,CHPA中分离的耐药亚群比非CHPA菌株更容易形成生物膜,在CHPA的耐药机制中,生物膜的形成与CHPA的发生具有相辅相成、互相促进的作用[4]。而CHPA来源的标本类型主要为痰,与呼吸机的应用相关。有学者指出,少数CHPA同时存在对多种抗生素HR的现象[4]。本研究结果显示,与MEM-非HR比较,MEM-HR 侵入治疗手段、多次感染比例均更高,WBC、BUN、Cr测量值均更低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与CHPA-非HR比较,CHPA-HR男性、侵入治疗手段、多次感染比例均更高,差异均有统计学意义(P<0.05)。可能与患者患有慢性基础疾病相关,患有多种基础疾病的患者基础情况较差、多数处于昏迷状态或病情较重,使得这部分患者容易感染HR菌。

综上所述,本院无菌体液分离的Pae中存在CHPA的情况。有学者指出,碳青霉烯类药物消耗的增加与碳青霉烯HR菌株的生长呈正相关,常规推荐剂量的抗生素对HR细菌引发的感染并非最佳治疗方案,若这些细菌长期处在抗生素的压力下容易引起耐药基因的突变而发展为多重耐药菌,导致治疗失败,甚至感染复发[14]。因此在进行药敏试验时可对易感人群补充临床常用抗菌药物的K-B法药敏试验,提高CHPA检出率;在治疗过程中应合理使用抗生素,且避免长期使用一种抗生素,且尽量联合用药,利用协同效应达到疗效,减少侵入性操作的次数、缩短置管时间等,进一步防控CHPA的感染和传播。