黄芩苷对大鼠横纹肌溶解综合征导致急性肾损伤的保护作用及机制研究*

李祖攀,谷 江△, 张永春,杨清滔,刘 淼

1.贵州医科大学附属医院泌尿外科,贵州贵阳 550004;2.武警贵州省总队医院泌尿外科,贵州贵阳 550005

多种机械或非机械原因造成的横纹肌溶解综合征(RM)有13.0%～50.0%会导致急性肾损伤(AKI),其病死率约为59.0%[1-2]。RM导致AKI的机制包括肾血管收缩、管型形成、肌红蛋白过氧化损伤、炎症及内质网应激等[3]。目前,RM导致AKI的治疗方法不多,并且经典药物治疗预后较差,血浆置换或血液透析等治疗经济成本高,且只能在医院完成治疗[4]。因此,研发RM导致AKI的新型药物成为当前该领域的研究热点。有研究表明,Klotho基因在多种病因导致的AKI中通过抗炎、抗氧化应激、抗凋亡等表现出肾保护作用,且Klotho基因可拮抗RM导致的AKI[5-6]。黄芩苷具有较强的生物活性,具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用,并且可提高Klotho基因表达后改善糖尿病小鼠模型的AKI[7-8],但目前将黄芩苷用于RM导致AKI的研究较少见。本研究构建RM导致AKI的大鼠模型,观察不同剂量黄芩苷对大鼠的保护作用,并探究其可能的作用机制,现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 选取健康SD雄性大鼠30只作为研究对象,体质量200～220 g。采用随机数字表法将其分为阴性对照组、阳性对照组、黄芩苷低剂量干预组(低剂量组)、黄芩苷中剂量干预组(中剂量组)和黄芩苷高剂量干预组(高剂量组),每组6只。常规鼠饵喂养,自由进食、进水,适应性饲养1周后进行实验干预。

1.2仪器与试剂 721分光光度计(上海跃进医疗器械有限公司);7170型全自动生化分析仪(日本日立公司);CFX96实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测仪(美国Bio-Rad公司)。黄芩苷(成都锦泰和医药化学技术有限公司);苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(碧云天生物技术公司);丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)(南京建成生物工程研究所有限公司);Trizol试剂(赛默飞世尔科技公司);实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒(日本TaKaRa公司);引物及逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)。

1.3方法

1.3.1模型制备与处理 动物实验严格按照《实验动物管理条例》及相关制度要求执行。经适应性饲养1周后禁食、禁水24 h。采用50.0%甘油,按10 mL/kg浓度注射大鼠双下肢肌肉,建立RM模型。将肾组织病理检测和肾功能检测结果作为AKI的判断标准。各干预组大鼠于注射甘油前20 min腹腔注射黄芩苷溶液,低、中、高剂量组注射分别为50、100、200 mg/kg。阳性对照组肌肉注射生理盐水。阴性对照组不做任何处理。所有实验大鼠均于药物干预5 h后采用股动脉放血法剖杀,收集血液标本,左肾多聚甲醛固定待病理检测,右肾液氮转运后于-80 ℃低温冰箱保存待用。

1.3.2血清生化指标检测 采用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、肌酸激酶(CK)水平。

1.3.3肾组织病理学检查 HE染色:将左肾组织石蜡切片脱蜡后浸入苏木素染色10 min,经1.0%盐酸乙醇、0.1%氨水处理后,浸入0.5%伊红染色2 min 。漂洗、脱水、透明后,采用中性树胶封固。

1.3.4肾组织SOD、MDA水平检测 取 1 g 肾组织加入玻璃匀浆管中制成组织匀浆,2 500 r/min离心 10 min,取上清液,采用比色法检测SOD、MDA水平。

1.3.5肾脏Klotho基因表达情况检测 大鼠右肾组织研磨后进行细胞裂解,使用Trizol试剂提取总RNA,经纯度检测后,将核酸纯度指示值(A260/A280)大于1.8的作为合格样品通过逆转录试剂盒合成模板单链DNA,使用PCR检测试剂盒进行RT-qPCR检测过程。引物序列分别为:Klotho基因正向引物为5′-CAATGGCTTCCCTCCTTTAC-3′,反向引物为5′-AGCACAGGTTTGCGTAGTCT-3′;β-actin基因正向引物为5′-TGACGTGGACAT CCGCAAAG3′,反向引物为5′-CTGGAAGGTGGAC AGCGAGG-3′。反应条件为:95 ℃ ,1 min;92 ℃,30 s;60 ℃,30 s;74 ℃,30 s。连续循环40次,每个样品均设置3个复孔。

2 结 果

2.1黄芩苷对RM大鼠肾组织的病理学影响 HE染色结果显示,阴性对照组大鼠肾小管基底膜完整,上皮细胞结构清晰,无炎症细胞浸润。阳性对照组大鼠可见肾小管上皮细胞坏死脱落,肾小管管腔扩张,肾间质水肿,有较多的炎症细胞浸润。黄芩苷干预组的肾组织损伤程度与阳性对照组比较均有所减轻,炎症细胞浸润明显减少,且随着黄芩苷剂量的升高,肾组织损伤程度明显减轻。见图1。

注:A为阴性对照组;B为阳性对照组;C为低剂量组;D为中剂量组;E为高剂量组。

2.2黄芩苷对RM大鼠肾组织血清BUN、Cr、CK水平的影响 阳性对照组血清BUN、Cr、CK水平明显高于阴性对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。低、中、高剂量组血清BUN、Cr、CK水平均高于阴性对照组,但明显低于阳性对照组,且高剂量组<中剂量组<低剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 黄芩苷对RM大鼠肾组织血清BUN、Cr、CK水平的影响

2.3黄芩苷对RM大鼠肾组织氧化应激指标水平的影响 阳性对照组和低、中、高剂量组血清MDA水平均明显高于阴性对照组,而血清SOD水平均明显低于阴性对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。与阳性对照组比较,血清MDA水平在黄芩苷低、中、高剂量组明显下降,且高剂量组<中剂量组<低剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05);血清SOD水平在黄芩苷低、中、高剂量组中明显高于阳性对照组,且高剂量组>中剂量组>低剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 黄芩苷对RM大鼠肾组织氧化应激指标水平的影响

2.4黄芩苷对RM大鼠肾组织Klotho基因表达的影响 RT-qPCR结果显示,阳性对照组的Klotho基因的表达量为(1.16±0.56),明显低于阴性对照组的(2.12±0.25),差异有统计学意义(P<0.05)。低、中、高剂量组Klotho基因表达量分别为(2.43±0.49)、(4.15±0.24)和(5.82±0.36),明显高于阴性对照组的(2.12±0.25),且高剂量组>中剂量组>低剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

AKI作为RM的常见并发症,病死率高且涉及的病理机制复杂,目前相关治疗手段尚待优化和提高[4]。因此,研究如何拮抗RM导致的AKI具有一定的临床意义。当前治疗RM导致AKI的方法主要为经典药物治疗和肾脏替代治疗,但其疗效不理想,且预后较差,仍需进一步探索RM导致AKI的分子机制,为研发新的靶向药物提供依据。

黄芩苷是黄芩中重要活性成分之一,是天然的抗氧化剂,具有明显的抗炎功效[9]。黄芩苷中的黄酮类和多酚类可有效清除活性氧自由基,对AKI有明显保护作用[10]。本研究实验大鼠经双后肢肌肉注射甘油,HE染色观察肾组织病理学变化,同时检测血清BUN、Cr、CK水平,构建RM导致AKI的大鼠模型。本研究结果显示,与阳性对照组比较,低、中、高剂量组血清BUN、Cr、CK水平均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。提示黄芩苷可改善大鼠AKI。

Klotho基因编码的单次跨膜蛋白在诊断AKI敏感性和特异性方面优于传统生物标志物,有望成为AKI早期诊断的新型生物标志物[11]。有研究证实Klotho是一种对AKI有保护作用的基因,可防御因缺血再灌注、氧化应激和RM等所致AKI[5]。在AKI中,肾小管上皮细胞大量坏死,机体释放的Klotho基因可降低血清BUN、Cr水平、抑制AKI标志物与促炎症细胞因子的表达。上调Klotho基因还可抑制肾小管上皮细胞坏死,促进肾小管细胞增殖[12]。既往有研究证实,黄芩苷可提高Klotho基因的表达,进而改善动物模型的AKI[8]。

RT-qPCR结果显示,不同剂量黄芩苷处理RM所致AKI大鼠后, 低、中、高剂量组Klotho基因表达量分别为(2.43±0.49)、(4.15±0.24)和(5.82±0.36),明显高于阴性对照组的(2.12±0.25),且高剂量组>中剂量组>低剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05)。提示黄芩苷可促进Klotho基因的表达,且黄芩苷剂量越大,Klotho基因的表达越高。本次研究还发现,黄芩苷处理RM所致AKI大鼠后,与阳性对照组比较,黄芩苷干预组血清MDA水平明显下降,且高剂量组<中剂量组<低剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05);血清SOD水平在黄芩苷低、中、高剂量组明显高于阳性对照组,且高剂量组>中剂量组>低剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05)。提示黄芩苷可减轻氧化应激,且剂量越高,氧化应激减轻程度越高。

综上所述,黄芩苷可明显改善大鼠RM导致的AKI,其机制可能与促进Klotho基因表达和减轻氧化应激相关。但本研究仍存在局限性,如尚不能明确黄芩苷促进Klotho基因表达和减轻氧化应激的具体机制,因此,黄芩苷的长期作用效应还需要进行深入研究。