血清miR-520h和miR-376c对妊娠期高血压患者发生妊娠结局不良的多因素分析及临床价值

吴丽华,陈 辰,高玲玲

复旦大学附属妇产科医院产科,上海 200090

妊娠期高血压(HDCP)是妊娠期特发疾病,其发病率为5%～10%,且呈逐年升高趋势[1]。HDCP一般发生在妊娠20周至分娩后2周,表现为血压升高,出现蛋白尿和水肿等症状,易导致多种妊娠结局不良的发生[2]。因此,发现早期预测HDCP患者发生妊娠结局不良的标志物,对改善母婴预后有重要意义。微小核糖核酸(miRNAs)是由22个核苷酸组成的单链非编码RNA,在基因的调控中发挥重要作用[3]。现有研究证实,子痫前期(PE)患者足月胎盘和血浆中的miR-376c水平降低,其被认为是PE诊断的标志物。并发现miR-376c可促进滋养细胞活力、迁移和侵袭,其水平下降会导致孕妇妊娠并发症的发生[4]。另一项研究显示,miR-520h在孕妇细胞、胎盘和血液中呈高水平,故被认为是PE诊断的重要标志物[5]。miR-520h和miR-376c对HDCP患者发生妊娠结局不良的诊断价值尚未明确。本研究通过观察HDCP患者血清miR-520h和miR-376c水平,分析其对HDCP患者发生妊娠结局不良的预测效能,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2021年1月至2022年12月于本院就诊的HDCP患者128例作为HDCP组,HDCP组年龄24～43岁,平均(31.66±4.50)岁;孕周36～40周,平均(38.16±0.87)周。根据HDCP患者的疾病严重程度分为妊娠高血压组54例,轻度PE组41例和重度PE组33例。另选取同期在本院体检的健康孕妇75例作为对照组,年龄24～43岁,平均(31.04±4.96)岁;孕周36～40周,平均(37.92±0.80)周。纳入标准:患者符合HCDP的诊断标准[6];单胎妊娠。排除标准:病历资料不完整;存在心、肝、肾等重要功能障碍;伴高血压、冠心病和肺病等慢性疾病;合并肿瘤或其他免疫性疾病;智力低下和有精神疾病;未定期进行产检。HDCP组与对照组研究对象年龄、孕周比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。所有患者均知情同意,并签署知情同意书,本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1血液标本留取 留取所有研究对象的清晨空腹静脉血10 mL,取5 mL放置在无抗凝剂的试管中,分离血清并将其放置在1.5 mL的离心管中,再将其置于在4 ℃的环境下按照3 000 r/min的速度离心10 min,然后以12 000 r/min的速度离心15 min,清除细胞沉积物后,将其置于-80 ℃的冰箱保存。另5 mL静脉血用于测定血脂和miRNAs水平。采用全自动生化仪(OTA-400 型,沈阳万泰医疗设备有限责任公司)测定血清血红蛋白、总胆固醇和甘油三酯。留取HDCP患者24 h尿液,通过生化分析仪测定24 h尿蛋白。所有的试剂盒均为配套试剂盒,严格按照说明书操作。

1.2.2实时荧光定量PCR 提取总RNA:采用Trizol 法对血浆进行总RNA提取,按照总RNA分离试剂盒说明书操作。合成cDNA:采用Taqman 探针法合成,首先配置反应体系。RNA 4.5 μL,RNA引物1.5 μL,无水核糖核酸酶(RNase)0.4 μL,脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.2 μL,10×buffer 0.8 μL和抑制剂0.1 μL。反应条件:在95 ℃的环境下先以起始模板预变性10 min,在中模板中95 ℃环境下变性15 s,在60 ℃环境下退火1 min,共循环40次。其中引物序列为miR-520h正向引物:5′-ACA AAGUGCUUCCCUUUAGA-3′,反向引物:5′-UCUAAAGGGAAGCACUUGUUU-3′。miR-376c正向引物:5′-GGGGACACTTTGGAC-3′,反向引物:5′-GGTCCGTGAGGGATGATGTC-3′。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)正向引物:5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3,反向引物:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。PCR反应体系:dNTP 1.6 μL、10 μmol/L的正反向引物1.0 μL、Taq DNA 聚合酶1.0 μL、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(2×)12.5 μL,加反应反冲液至25.0 μL。PCR反应条件:在95 ℃环境下变性10 s,在65 ℃环境下退火20 s,在75 ℃环境下延伸在15 s,共40个循环。以2-ΔΔCt计算出miR-520h和miR-376c的水平。

1.2.3妊娠结局 选择发生早产、胎膜早破、产后出血、胎儿生长受限、新生儿窒息和胎儿窘迫等的HDCP患者为妊娠结局不良组(55例),其余患者为妊娠结局良好组(73例)。

1.2.4观察指标 观察HDCP组和对照组血清miR-520h和miR-376c水平变化;比较HDCP患者妊娠结局良好组与不良组的一般资料及实验室指标;分析HDCP患者发生妊娠结局不良的多因素;比较不同严重程度HDCP患者的血清miR-520h和miR-376c水平;评估血清miR-520h和miR-376c水平对HDCP患者发生妊娠结局不良的预测效能。

2 结 果

2.1HDCP组和对照组患者血清miR-520h和miR-376c水平比较 HDCP组血清miR-520h水平高于对照组,而血清miR-376c水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 HDCP组和对照组患者血清miR-520h和miR-376c水平比较

2.2不同严重程度HDCP患者的血清miR-520h和miR-376c水平比较 重度PE组患者的血清miR-520h水平高于轻度PE组和妊娠高血压组,轻度PE组患者的血清miR-520h水平高于妊娠高血压组,差异均有统计学意义(P<0.05);重度PE组血清miR-376c水平低于轻度PE组和妊娠高血压组,轻度PE组低于妊娠高血压组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同严重程度HDCP患者的血清miR-520h和miR-376c水平比较

2.3HDCP患者妊娠结局良好组与妊娠结局不良组的一般资料及实验室指标比较 两组发病孕周、不同HDCP严重程度及收缩压、24 h尿蛋白和血清miR-520h和血清miR-376c水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 HDCP患者妊娠结局良好组与不良组的一般资料及实验室指标比较或n(%)]

2.4影响HDCP患者妊娠结局的二元Logistic回归分析 将表3中差异有统计学意义的指标[发病孕周(≥38周=1,<38周=0)、HDCP严重程度(妊娠期高血压=1,轻度PE=2,重度PE=3)、收缩压(≥131.12 mmHg=1,<131.12 mmHg=0)、24 h尿蛋白(≥5.97 g/24 h=1,<5.97 g/24 h=0)、miR-520h(≥2.70=1,<2.70=0)和miR-376c(≥1.67=1,<1.67=0)]进行赋值,根据是否发生妊娠结局不良进行二元Logistic回归分析,结果显示发病孕周≥38周、HDCP严重程度越高、血清miR-520h≥2.70是HDCP患者发生妊娠结局不良的危险因素(P<0.05),miR-376c≥1.67是HDCP患者发生妊娠结局不良的保护因素(P<0.05)。见表4。

表4 HDCP患者妊娠结局影响因素的二元Logistic回归分析

2.5血清miR-520h和miR-376c水平对HDCP患者发生妊娠结局不良的预测效能 根据HDCP患者是否发生妊娠结局不良进行Logistic分析,联合应用时建立回归预测模型:Y= 1.39×XmiR-520h-3.73×XmiR-376c+1.65。结果显示血清miR-520h和miR-376c联合检测的灵敏度为76.4%,特异度为94.5%,曲线下面积(AUC)为0.929高于miR-520h(AUC=0.805)和miR-376c(AUC=0.880)单独检测。见表5。

表5 血清miR-520h和miR-376c水平对HDCP患者发生妊娠结局不良的预测效能

3 讨 论

HDCP是最常见的妊娠特有的并发症,随着病情加重,患者常发生妊娠结局不良。HDCP病理基础是全身小血管痉挛导致胎盘供血减少,出现滋养细胞侵袭不足,引起母婴并发症发生[7-8]。目前尚未找有效预测HDCP患者发生妊娠结局不良的灵敏指标。miRNA对细胞增殖、分化和凋亡有明显的调控作用,在维持胎盘功能稳态中起到重要作用,有望成为预测HDCP患者发生妊娠结局不良的灵敏指标[9-10]。因此本研究采用血液作为标本,检测HDCP患者血清miR-520h、miR-376c水平,观察其在HDCP患者发生妊娠结局不良的预测价值,因为miRNA在血液中较为稳定,可以在反复冻融,且不同酸碱度和裂解酶的条件下保持miRNA的稳定性,同时血液标本易得,可重复检测。

本研究表明,HDCP组血清miR-520h水平高于对照组,并且随着HDCP严重程度升高而升高,差异均有统计学意义(P<0.05),说明miR-520h与HDCP的发生发展有关。有研究证实miR-520h水平在晚期乳腺癌患者中明显升高,认为miR-520h是一种对癌细胞具有保护作用的RNA,是肿瘤细胞复发和转移的潜在标志物[11-12]。有研究表明,miR-520h在复发性流产患者的绒毛组织中呈高水平,可导致DNA损伤,促进滋养细胞凋亡,并提示miR-520h作为一种新的抑制因子可能与复发性流产有关[13]。有研究显示,miR-520可通过抑制核因子-kB信号激活,减少炎症因子释放,调控炎症的发生发展[14]。本研究通过二元Logistic回归分析发现miR-520h水平升高是HDCP患者发生妊娠结局不良的危险因素(P<0.05),提示血清miR-520h水平越高,孕妇发生妊娠结局不良的可能性越高。因此对这类患者是否要采取干预措施,需进一步研究。

本研究结果显示,HDCP组血清miR-376c水平低于对照组,并且血清miR-376c水平随着HDCP严重程度升高而降低,差异均有统计学意义(P<0.05),说明miR-376c参与了HDCP的发生发展。miR-376c在多种肿瘤细胞中的水平不一,在子宫颈癌[15]和胆管癌[16]等肿瘤中呈高水平,而在卵巢癌[17]中呈低水平,作为抑癌基因参与肿瘤细胞增殖、迁移和转移等生物学行为,从而影响肿瘤细胞增殖和凋亡。在关于HDCP的研究中发现,miR-376c水平在PE胎盘中明显降低,并与胎盘细胞的增殖和胎盘的发育有关,因此认为胎盘miR-376c水平降低,可以导致胎盘异常发育甚至发生孕妇早产[18]。本研究显示,miR-376c水平上升是HDCP患者发生妊娠结局不良的保护因素(P<0.05);血清miR-520h和miR-376c联合预测HDCP患者发生妊娠结局不良的AUC为0.929,明显高于各项指标单独预测,说明miR-520h和miR-376c在诊断HDCP患者发生妊娠结局不良方面具有某种互补性,2个基因水平具有某种平衡,这种平衡被打破可能导致患者发生妊娠结局不良,对于2个基因水平均异常的患者,是否需要采取进一步的干预措施,需要在未来的研究中进行证实。

总之,血清miR-520h和miR-376c参与HDCP的发生发展,联合检测miR-520h和miR-376c水平有助于预测HDCP患者妊娠结局。