基于网络药理学探究虎杖治疗非酒精性脂肪性肝炎的作用机制#
2023-09-12杨海燕黄云霞文静
杨海燕 黄云霞 文静
（1. 川北医学院附属医院，四川 南充 637000；2. 川北医学院药学院，四川 南充 637000）
非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球范围内最为常见的肝脏疾病之一，患病率约为25%，发病机制较为复杂且认知有限，因而尚无针对NAFLD 有效的治疗方法[1-2].。根据其组织学的不同，NAFLD 可分为非酒精性单纯性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver，NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）两种，前者仅存在肝细胞变形而无明显的肝细胞损伤，通常注意饮食可得到改善；而后者为NAFLD 的严重病理类型之一，易演变为晚期肝硬化、肝纤维化、肝癌等恶性肝病，造成不可逆后果[3-5]。因此，寻找针对NASH 治疗的有效药物、探究其作用机制对该病的临床治疗及科学研究均具有十分重要的意义。虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.的干燥根茎和根，有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功（2020 版《中华人民共和国药典》（一部））。现代药理学研究发现，虎杖具有抗炎、抗氧化、调节代谢、改善微循环、肝保护、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、神经保护、血管新生等生物活性[6-7]，可改善酒精性脂肪肝[8]、非酒精性脂肪肝[9]、肝脏缺血再灌注损伤[10]等引起的肝损伤，发挥一定的保肝作用。但有关虎杖对非酒精性脂肪性肝炎的报道较少，且多为复方研究，对其作用机制更是知之甚少。
由于虎杖具有多成分、多靶点、多通路的特点，为探究其对NASH 的保护作用，此研究采用网络药理学技术预测虎杖治疗NASH 的主要活性成分及潜在靶点，探究其主要作用机制，为临床虎杖治疗NASH 提供一定的参考，并为NASH 的治疗提供一定的新想法及新思路。
1 材料与方法
1.1 虎杖活性成分及靶点的获取
借助中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，http：//tcmspw. com/tcmsp.php），以OB＞30%，DL＞0.18 为筛选条件获取虎杖的活性成分，并以各活性成分CAS 号于Pubmed compound 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载其2D 结构式，保存为sdf 格式，将其结构式导入 Pharmmapper 数据库（http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/）获得各活性成分的作用靶点，将其靶点通过 Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org）标准化为Gene Symbol 格式，筛除重复项后得到虎杖活性成分作用靶点。
1.2 非酒精性脂肪性肝炎靶点的获取
以“NASH”、“non-alcoholic steatohepatitis”为关键词于Genecards（https://www.genecards.org/）、Disgenet（https://www.disgenet.org）、OMⅠM（https://www.omim.org）等数据库下载相关靶点，筛除重复项后获得NASH 相关靶点。
1.3 韦恩图及成分-靶点网络图的构建
分别将获得的虎杖活性成分作用靶点与NASH 相关靶点导入微生信在线制图平台（www.bioinformatics.com.cn）绘制韦恩图，获取二者交集靶点；并通过Cytoscape 3.9.1 软件构建成分-靶点网络图，预测虎杖治疗NASH 的主要活性成分。
1.4 蛋白互作网络图（Protein-protein interaction，PPⅠ）建立的绘制及核心靶点的获取
将虎杖活性成分与NASH 的交集靶点导入String 数据库（https://string-db.org/）蛋白种属选择“Homo sapiens” ， 设定“minimum required interaction score”的“medium confidence=0.9”，获得PPⅠ网络图，将该网络图导入Cytoscape 3.9.1 软件进行美化并借助Cytohubba 插件获取“Top 10”核心靶点，预测虎杖治疗NASH 的关键靶点。
1.5 基因本体（Gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析
将虎杖作用于 NASH 潜在靶点导入Metascape 平台（https:// metascape. org/gp/ index.htmL#/main/step1）进行GO 及KEGG 富集分析，限定物种类型为“Homo sapiens”，以min overlap=3、P≤0.05、min enrichment=1.5 为筛选范围，筛选排名前15 的生物功能及通路过程，通过微生信在线绘图平台（www.bioinformatics.com.cn）将结果可视化。
1.6 靶点-通路网络的构建
将虎杖作用于NASH 潜在靶点数据通过Cytoscape 3.9.1 绘制靶点通路网络图进行可视化。
2 结果
2.1 虎杖主要活性成分作用靶点
通过TCMSP 数据库以OB＞30%，DL＞0.18为筛选条件，获得虎杖10 个主要活性成分，将其结构式导入Pharmmapper 数据库获得各活性成分作用靶点，筛除重复项后得到虎杖主要活性成分作用靶点436 个。
2.2 NASH 相关作用靶点
通过Genecards、Disgenet、OMⅠM 数据库下载NASH 相关作用靶点，删除重复项后得到3944个NASH 相关靶点。
2.3 韦恩图及成分-靶点网络得构建
将虎杖主要活性成分靶点及NASH 相关作用靶点导入微生信在线制图平台绘制韦恩图，获得二者交集靶点81 个，见图1，表明虎杖可能通过此81 个靶点作用于NASH 发挥治疗作用。并借助Cytoscape3.9.1 软件将10 个活性成分及81 个潜在作用靶点绘制成分-靶点网络图，如图2所示。按照度值（表1）对活性成分进行排序，筛选出靠前的主要活性成分为 6,8-Dihydroxy-7-methoxyxanthone 、luteolin、Physovenine，分别可与67、65、63 个靶点发生作用，表明此三者为虎杖作用于NASH 的主要活性成分。
表1 虎杖主要活性成分及度值
图1 虎杖治疗NASH 交集靶点的韦恩图
图2 成分-靶点网络
2.4 PPⅠ网络图及核心靶点
将虎杖-NASH 交集靶点导入String 数据库设置“medium confidence=0.9”获得PPⅠ网络，该网络图包含81 个节点，134 条边，通过Cytoscape 3.9.1软件对该网络图进行美化，如图3 所示。借助Cytohubba 插件获取“Top 10”核心靶点，如表2、图4 所示，该结果表明，虎杖主要通过作用于SRC、RXRA、GRB2、AKT1、RXRB、ESR1、STAT1、JAK2、ⅠGF1、ⅠGF1R 等关键蛋白发挥对NASH 的治疗作用。
表2 核心靶点度值及介度中心数
图3 PPI 网络图
图4 “Top 10”核心靶点网络
2.5 GO 及KEGG 富集分析
将虎杖作用于 NASH 潜在靶点导入Metascape 平台，限定物种类型为“Homo sapiens”，以min overlap=3、P≤0.05、min enrichment=1.5 为筛选范围进行GO 功能注释，得到生物过程（Biological process，BP）条目1092 个、细胞组分（Cellular component，CC）条目49 个、分子功能（Molecular function，MF）条目98 个。将p 值前15 的条目通过微生信在线制图平台进行可视化，如图5 所示。结果表明，虎杖治疗NASH 可能通过调节细胞对脂质的反应（Cellular response to lipid）、激素反应（Response to hormone）、细胞内受体信号通路（Ⅰntracellular receptor signaling pathway）等生物过程；受体复合物（Receptor complex）、膜筏（Membrane raft）、膜微结构域（Membrane microdomain）等细胞组分；核受体活性（Nuclear receptor activity）、配体激活的转录因子活化（Ligand-activated transcription factor activity）等分子功能。
图5 GO 功能富集分析
将虎杖作用于 NASH 潜在靶点导入Metascape 平台，限定物种类型为“Homo sapiens”，以min overlap=3、P≤0.05、min enrichment=1.5 为筛选范围进行KEGG 富集分析，富集到130 条信号通路。按P 值大小将前15 条通路借助微生信在线制图平台进行可视化，如图6 所示。结果提示虎杖可能通过调节癌症通路（Pathways in cancer）、PⅠ3K/Akt 信号通路、化学致癌作用-受体激活（Chemical carcinogenesis - receptor activation）、蛋白聚糖在癌症中的应用（Proteoglycans in cancer）、肝癌、Ras 等信号通路发挥对NASH 的治疗作用。
图6 KEGG 富集分析
2.6 靶点-通路网络
采用Cytoscape 3.9.1 软件绘制靶点-通路网络，如图7 所示。按度值大小排序，发现AKT、EGFR、GRB2、ⅠGF1R、SRC、ⅠGF1、MDM2、MET、RAC1、MMP9 等靶点与主要调节信号通路关系较为密切，表明这些靶点可能在虎杖治疗NASH 过程中发挥关键作用。
图7 靶点-通路网络
3 讨论
NASH 为NFALD 进展为肝硬化、肝纤维化、肝癌的关键性环节，主要表现为肝脂肪变、肝细胞损伤、炎症、纤维化、内质网应激、线粒体功能障碍等，治疗主要针对糖脂代谢紊乱、炎症、细胞凋亡、纤维化、改善胰岛素抵抗、调节肠道菌群等[11-12]。近年来多项研究发现虎杖及其复方可以发挥抗炎、抗氧化、改善胰岛素抵抗、调节脂质代谢、抑制内质网应激等药理活性改善肝脏疾病损伤[7,13-14]，但对NASH 的研究较少，且机制尚不明确。
本研究应用网络药理学技术探究虎杖治疗NASH 的潜在靶点及作用机制，筛选得到虎杖主要活性成分10 个、活性成分作用靶点436 个、NASH 疾病靶点3944 个，二者交集靶点81 个。通过构建成分靶点网络、PPⅠ网络、GO、KEGG富集分析分析有关成分、靶点、作用途径、通路之间的关系。结果显示，6,8-Dihydroxy-7-methoxyxanthone 、luteolin、Physovenine 可能为虎杖改善NASH 的主要活性成分。6,8-Dihydroxy-7-methoxyxanthone、luteolin 均为黄酮类化合物，现代研究表明，黄酮类化合物可通过抗炎、抗氧化、抗凋亡、抑制细胞外基质、的异常堆积、调节脂质代谢等作用改善肝纤维化、酒精性肝病所致肝细胞损伤从而发挥保肝作用[15-17]。PPⅠ拓扑分析发现SRC、RXRA、GRB2、AKT1、RXRB、ESR1、STAT1、JAK2、ⅠGF1、ⅠGF1R 可能为虎杖改善NASH 的潜在靶点。
非受体酪氨酸激酶SRC 在肿瘤的存活、增殖、迁移过程中扮演着重要的角色，研究发现抑制SRC 表达可抑制肝癌细胞的转移，对肝癌的发生有一定的改善作用[18-19]；RXRA、RXRB 均属维甲酸受体家族蛋白，研究表明RXRA 在肝脏中大量表达，可通过调控其表达发挥抗炎、调节代谢、抗凋亡等改善肝纤维化[20-21]；GRB2 在肿瘤疾病的发生发展过程中异常表达，实验证实抑制GRB2 的表达可抑制肝癌细胞侵袭及增殖[22-23]；AKT1 与细胞增长、凋亡等密切相关，在肝癌的发生过程中具有重要的意义，抑制其表达可抑制肝癌细胞增殖并促使其凋亡[24]；同样的，ESR1 的表达也与肝癌细胞增殖呈现一定的相关性[25]；STAT1、JAK 参与细胞增殖、凋亡、免疫、线粒体功能、内质网应激等调节，可改善肝癌、肝衰竭、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎等肝脏相关疾病[26-29]；ⅠGF1、ⅠGF1R 为合成代谢相关因子，调控其表达可抑制脂质蓄积及纤维化，改善非酒精性脂肪肝[30]，且其表达还与肝癌细胞的增殖有关[31]。GO 富集分析结果表明虎杖治疗NASH 可能通过调节细胞对脂质的反应（Cellular response to lipid）、激素反应（Response to hormone）、细胞内受体信号通路（Ⅰntracellular receptor signaling pathway）等生物过程；受体复合物（Receptor complex）、膜筏（Membrane raft）、膜微结构域（Membrane microdomain）等细胞组分；核受体活性（Nuclear receptor activity）、配体激活的转录因子活化（Ligand-activated transcription factor activity）等分子功能。KEGG 富集分析结果表明结果提示虎杖可能通过调节癌症通路（Pathways in cancer）、PⅠ3K/Akt 信号通路、化学致癌作用-受体激活（Chemical carcinogenesis - receptor activation）、蛋白聚糖在癌症中的应用（Proteoglycans in cancer）、肝癌、Ras 等信号通路发挥对非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用。癌症、肝癌等相关通路主要涉及基因突变、凋亡、细胞周期、细胞增殖转移等过程[32]；PⅠ3K-Akt 信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡过程[33-34]，且在炎症及氧化应激等过程中也发挥作用[35-36]。Ras 通路被证实参与肝炎、肝纤维化等肝病发生发展过程，可能机制与抗炎、抗凋亡有关[37]。
综上所述，虎杖可能通过调节癌症、PⅠ3K/Akt、肝癌、Ras 信号通路以调节SRC、RXRA、GRB2、AKT1、RXRB、ESR1、STAT1、JAK2、ⅠGF1、ⅠGF1R等蛋白的表达发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡、调节脂质代谢、抑制细胞增殖等作用改善NASH 损伤。
