有机磷农药敌百虫胁迫对东北蝲蛄毒性效应研究※

●蒋翠红 杨翼羽 于林海※※ 郭贵良 修 磊孙 丽 潘发林 于 涵 李 霞 汪 朕

（1.长春市水产品质量安全检测中心 吉林 长春 130033；2.敦化市水产技术推广站 吉林 敦化 133700）

敌百虫（Dipterex，O，O-二甲基-（2，2，2-三氯-1-羟基乙基）磷酸酯）是有机磷脂类化合物，化学式为C4H8Cl3O4P，在农畜渔业中被广泛应用，是目前最常用的有机磷杀虫剂之一[1-2]。但有机磷农药作为农业面源污染的一大污染物，超量使用可使其在土壤和水体中富集，污染水质[3-4]。敌百虫可用于防治鱼体内外寄生虫病[5]，但过量及长期使用会残留在鱼体，对其造成伤害，威胁人体健康[6]。

东北蝲蛄（Cambaroides dauricus）隶属于节肢动物门、软甲纲、十足目、正螯虾科（蝲蛄科）、蝲蛄属，是世界淡水鳌虾的一种，学名东北螯虾，俗称蝲蛄、水蝲蛄、蝲蛄夹、石蟹、鳌虾、龙虾、长白山龙虾、东北小龙虾、大头虾、草龙虾等。东北蝲蛄是东北地区著名珍稀土著经济水产品之一，食用价值很高。其肉质鲜嫩、风味独特、营养丰富、且易消化，肌肉中富含钙、磷、镁等，对心脏有很好的功能调节作用，对身体虚弱及病后需调养的人也是极好的食物。研究还发现，蝲蛄体内的虾青素有助于消除因时差反应而产生的“时差症”[7]。此外，东北蝲蛄还是著名中药材蝲蛄石的原料，药用价值很高。目前，大规格的东北蝲蛄市场价格达到500 元/kg 以上，且很难买到，其人工养殖产业具有良好市场前景[8-12]。

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和总抗氧化能力（T-AOC）是经典的反应生物机体氧化胁迫状况的生理指标，在外源污染物对水生动物氧化应激损伤研究中应用较多[13]。监测水体中全部污染物含量不切实际，但可通过水生生物暴露在污染物下生化指标的变化来反映其个体生理过程潜在损害的程度，以此来评价水体生态环境质量是可行的[14-15]。目前，关于敌百虫胁迫对东北蝲蛄的毒性效应研究尚未见报道，因此研究敌百虫胁迫对东北蝲蛄养殖具有重要意义。通过敌百虫对东北蝲蛄胁迫试验，测得半致死浓度及安全浓度，讨论敌百虫对东北蝲蛄肝胰脏组织中SOD、CAT、MDA、GSH 和T-AOC 几种典型氧化胁迫相关指标的影响，旨在进一步探讨敌百虫对东北蝲蛄的毒副作用及机制，以此评价敌百虫污染水体对东北蝲蛄可能产生的毒理学影响因素，为东北蝲蛄健康生态养殖和水产品安全评价提供基础数据，为安全使用该类农药提供科学依据。同时，东北蝲蛄可作为环境敏感生物，为渔业资源科学监控和管理提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验对象从敦化市购回活泼健康、体色正常的东北蝲蛄作为受试生物。东北蝲蛄在实验室玻璃水族箱中暂养7 d，期间连续充气，每天定时定量投喂鱼饲料，实验前24 h 停止喂食。急性毒理试验所用容器为45 cm×25 cm×35 cm 方形玻璃水族箱，实验用水为自来水充分曝气7 d，试验过程中全天持续充气，每天定时测定试验养殖水体的水温、电导率、溶解氧和pH，试验期间水温（22.1±0.2）℃，电导率（337.8±4.8）μs/cm，溶解氧（DO）（7.0±0.1）mg/L，pH 值（8.10±0.04）。

1.1.2 试验药品敌百虫［农药生许（鲁）0170］可溶粉剂，有效成分含量为90%，为山东大成生物化工有限公司生产；冰醋酸（分析纯），购于北京化工厂；无水乙醇（分析纯）购于北京化工厂。根据敌百虫有效成分，试验前用蒸馏水将其配置成一定浓度的母液备用，试验时将母液稀释成所需浓度使用。现用现配。

1.1.3 试验仪器紫外可见分光光度计（普析TU1900）；离心机（Hermle Z216 MK）；电热恒温水浴锅（博讯 HHS-21-6）；电子分析天平（METTLER TOLEDO AL204）；移液枪（Thermo）；便携式多参数水质分析仪（YSI Pro 2030）；pH 计（Thermo）。

1.2 试验方法

1.2.1 急性毒性试验采用静水式试验法，试验期间不更换药，不换水，进行人工增氧，为防止饲料影响，试验期间不投饵。挑选体格强壮、规格基本一致的东北蝲蛄进行预试验，确定24 h 使东北蝲蛄全部死亡和96 h 全部存活的浓度范围[6]。根据预试验结果按等比设7 个浓度组（0.23，0.47，0.94，1.88，3.75，7.50，15.00 mg/L），同时设空白对照组，每组3 个平行，每个水族箱放水20 L，随机各放入10 尾东北蝲蛄，其平均体长为（4.30±0.23）cm，平均体重为（7.76±1.63）g。试验开始后观察东北蝲蛄游动等生活状态，记录其在12，24，48，72，96 h 的活动和死亡状况，以沉底、丧失游泳能力、对外界刺激无反应作为死亡标准，并及时捞出死亡个体。

1.2.2 氧化胁迫相关指标试验与上述急性毒性试验方法相同，每个水族箱随机各放入15 尾东北蝲蛄，每24 h 取出各个梯度三尾东北蝲蛄，迅速取出肝胰脏组织，用0.86%预冷生理盐水淋洗、滤纸吸附。称取0.5 g 肝胰脏组织，按重量（g）、体积（mL）1∶9 的比例，加入9 倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制备成10%的匀浆液，2500 r/min，离心10 min，取上清液待测。SOD、MDA、CAT、GSH、T-AOC 均采用南京建成公司生产的试剂盒进行测定。总蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法。

1.3 数据处理及分析

采用Bliss 法（概率单位法）计算敌百虫对东北蝲蛄的急性毒性数据LC50[16]；单因素方差分析（ANOVA），比较不同处理组间相关指标的差异显著性，并应用LSD 检验法进行均值间多重比较，差异显著性水平P＜0.05。所有统计分析均采用SPSS17.0 统计软件进行。结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 敌百虫胁迫对东北蝲蛄急性毒性的影响

在整个急性毒性试验过程中，观察不同浓度敌百虫胁迫下东北蝲蛄的生活行为。对照组全部东北蝲蛄在整个试验过程中呼吸、泳动、对外界物理刺激（如轻敲箱壁）等行为无明显变化。受试东北蝲蛄中毒症状：初期，先表现出急躁不安，出现活动异常、狂游冲撞、间歇性急速后退等反应。随时间延长，呈痉挛性抽搐，失去平衡，仰卧水底，附肢无力划动直至死亡。敌百虫浓度越高，东北蝲蛄的中毒症状越明显、越迅速，而在低浓度组中，经过很长时间后才有个别受试东北蝲蛄出现异常症状。

随着敌百虫浓度增加，东北蝲蛄死亡率逐渐提高，呈明显的剂量-效应关系（图1），可见，随敌百虫浓度的增大及时间的延长，东北蝲蛄对其耐受力不断减弱。

图1 不同敌百虫浓度下东北蝲蛄死亡率

敌百虫对东北蝲蛄24、48、72、96 h 的LC50值分别为2.07，1.02，0.67，0.47 mg/L（表1），安全浓度（SC）通过公式SC=96 h LC50×0.1 计算得到[17]，为0.047 mg/L。由于敌百虫对生物体的毒副作用，因此确定其对东北蝲蛄的安全浓度尤为重要。化学物质对鱼类的急性毒性按LC50值的大小分为剧毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5 个等级[18]，据此判断，敌百虫对东北蝲蛄为高毒甚至剧毒物质。

表1 敌百虫对东北蝲蛄的急性LC50 值及95%置信区间

2.2 敌百虫胁迫对东北蝲蛄肝胰脏抗氧化性能的影响

2.2.1 敌百虫对东北蝲蛄肝胰脏SOD 活力的影响不同浓度敌百虫对东北蝲蛄肝胰脏组织SOD活力的影响，见图2。

由图2 可见，不同时间段和浓度敌百虫胁迫对东北蝲蛄肝胰脏SOD 活力均有诱导作用。低浓度处理组（0.23 mg/L）肝胰脏组织SOD 活力被诱导升高，在24、48、72 h 与对照组有显著性差异（P＜0.05）。中高浓度各处理组（0.47，0.94，1.88，3.75，7.50，15.00 mg/L）SOD 活力在24、48h 分别各自呈现升高趋势；72、96 h，1.88 mg/L 处理组SOD 活力升高最为明显。中低浓度各处理组（0.23，0.47，0.94 mg/L）SOD 活力随着胁迫时间的延长分别各自呈先升高再降低的趋势。

2.2.2 敌百虫对东北蝲蛄CAT 活力的影响不同浓度敌百虫对东北蝲蛄肝胰脏组织CAT 活力的影响，见图3。

图3 敌百虫浓度及时间对东北蝲蛄肝胰脏组织CAT 活力的影响

由图3 可知，在整个试验过程中，中低浓度各处理组（0.23，0.47，1.88 mg/L）CAT 活力随着胁迫时间的延长分别各自呈现先升高再降低；中浓度处理组（0.94 mg/L）CAT 活力随着胁迫时间的延长呈降低趋势。48 h 时，与对照组相比，中浓度处理组（1.88 mg/L）肝胰脏组织CAT 活力随着胁迫时间的延长显著升至最高（P＜0.05）。高浓度处理组（15.00 mg/L）CAT 活力均低于同一时间段其它各浓度组的CAT 活力。试验结束时（96 h），敌百虫各浓度处理组CAT 活力与对照组无明显差异（P＞0.05）。

2.2.3 敌百虫对东北蝲蛄MDA 含量的影响不同浓度敌百虫对东北蝲蛄胰脏组织MDA 含量的影响，见图4。

图4 敌百虫浓度及时间对东北蝲蛄肝胰脏组织MDA 含量的影响

由图4 可知，在整个试验过程中，中低浓度处理组（0.23，0.47，0.94，1.88，3.75 mg/L）与对照组MDA 含量均无显著性差异（P＞0.05），而高浓度处理组（15.00 mg/L）MDA 含量则显著高于对照组（P＜0.05）；试验结束时（96 h），高浓度处理组（15.00 mg/L）MDA 含量高出对照组49.9%（P＜0.05）。

2.2.4 敌百虫对东北蝲蛄GSH 含量的影响不同浓度敌百虫对东北蝲蛄肝胰脏组织GSH 含量的影响，见图5。

图5 敌百虫浓度及时间对东北蝲蛄肝胰脏组织GSH 含量的影响

由图5 可知，在24 h 短时间内，敌百虫胁迫中浓度处理组（0.47，0.94，1.88，3.75 mg/L）与对照组相比便显著降低（P＜0.05）；在48、72、96 h，与对照组相比，同一时间段不同浓度东北蝲蛄肝胰脏GSH 含量表现为显著性降低（P＜0.05）。随敌百虫胁迫时间的延长，各时间段对照组GSH 含量呈现下降趋势；在试验结束时（96 h），对照组GSH 含量仍显著高于同时间段各敌百虫胁迫组（P＜0.05）。

2.2.5 百虫对东北蝲蛄T-AOC 水平的影响不同浓度敌百虫对东北蝲蛄肝胰脏组织T-AOC 水平的影响，见图6。

图6 敌百虫浓度及时间对东北蝲蛄肝胰脏组织T-AOC 水平的影响

由图6 可知，不同时间段不同浓度敌百虫对东北蝲蛄肝胰脏T-AOC 水平均有诱导作用。低浓度处理组（0.23 mg/L）肝胰脏组织T-AOC 水平有升高趋势，48、72、96 h 时与对照组存在显著性差异（P＜0.05）。中浓度处理组（0.47，0.94，1.88，3.75 mg/L）T-AOC 水平在24、48、72h 分别各自呈现逐渐升高。在试验结束时（96 h），高浓度处理组（15.00 mg/L）T-AOC 水平与对照组相比显著升高67.8%（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 敌百虫对东北蝲蛄的毒性

有机磷农药敌百虫能杀灭寄生虫，同时对水体中的水生生物也能产生毒副作用，特别是其水解以后，胆碱酯酶的活性受到抑制，不能分解体内的乙酰胆碱，使之造成蓄积，使甲壳类动物的神经系统功能紊乱，最终致其死亡[19]。一般当组织胆碱酯酶抑制达40%～60%时，动物可在几秒钟内死亡[20]。有研究显示，敌百虫对克氏原螯虾24、48 h LC50分别为4.94，2.78 mg/L，SC为0.264 mg/L[21]。由此可见，东北蝲蛄对敌百虫的耐受力比克氏原螯虾差，东北蝲蛄对敌百虫比克氏原螯虾更为敏感。东北蝲蛄对敌百虫的耐受力比鱼类要低得多，有研究表明，敌百虫对异育银鲫仔鱼（1.0 g±0.3 g）48，72，96 h LC50分别为121.19，90.22，59.78 mg/L，SC 为5.98 mg/L；对异育银鲫鱼种（23.2 g±3.6 g）48 h LC50为411.65 mg/L[6]；对5 日龄大鳞副泥鳅24、48 h LC50分别为7.52，4.89 mg/L，SC 为0.40 mg/L[1]。在用敌百虫防治鱼体内外寄生虫病时，其常用剂量一般为0.2～0.5 mg/L[6]，而本试验中首次确定了敌百虫对东北蝲蛄的SC 为0.047 mg/L，说明东北蝲蛄对敌百虫极为敏感，且作为鱼药，敌百虫主要用来杀灭鱼体外寄生的甲壳动物[22]，故在东北蝲蛄的养殖过程中，不能使用敌百虫进行寄生虫病防治，同时还要防止被农药污染的水进入养殖池。试验观察到在低浓度组96 h 后存活下来的东北蝲蛄个体很少死亡，表明东北蝲蛄受到轻度影响后也有一定存活率，因此，可采用微生物及其产生的降解酶降解水体中的有机磷农药[20，23]，从而净化水质。

此外，在预试验期间，由于东北蝲蛄正处于蜕壳高峰的生长旺季期，再加上敌百虫药物刺激，使受试东北蝲蛄蜕壳周期明显缩短，更易脱壳。这一应激反应，可能是东北蝲蛄受外部环境刺激的一种自我保护机制，因东北蝲蛄吸收毒物后，可经代谢将毒物富集到体壁，随蜕壳过程排出体外，以此减轻对机体的毒害作用[24]，这也表明东北蝲蛄对环境污染敏感。但蜕壳后的新皮又软又薄，因体表吸水膨胀，更易吸收毒物，反而加速东北蝲蛄的死亡。试验发现多数东北蝲蛄在蜕壳过程中或蜕壳后不久死亡，说明在蜕壳阶段，东北蝲蛄对药物的耐受性降低，这与有关研究结果相符[22]。因此，在施药后短时间内出现东北蝲蛄大量蜕壳时，要注意调节水质；同时，蜕壳高峰期应避开用药。正式试验期间，几乎未见东北蝲蛄蜕壳，可能是因为其过了易蜕壳的生长旺季期，不易脱壳，就将毒物富集起来。

3.2 敌百虫胁迫对东北蝲蛄肝胰脏抗氧化性能的影响

当水体环境不在水生生物生存的适宜范围内时，会使其产生应激反应，持续应激会影响其免疫防御功能，最终可能出现病害和死亡。环境胁迫能导致生物体有氧代谢异常，活性氧自由基大量累积，引发脂质过氧化，进而形成过氧化终产物MDA，而肝胰脏细胞受到外界刺激，细胞分泌酶量增多[25]。此时，机体内SOD、CAT 等抗氧化酶联合作用和GSH 等抗氧化物质能及时、有效地清除自由基，缓解机体的氧化损伤，这是机体防止中毒和克服不良环境的一种适应性反应[26-27]，对机体的氧化与抗氧化平衡起重要作用。抗氧化物质可通过保护SOD、CAT 等抗氧化酶的活性来发挥作用，故常用SOD、CAT、MDA、GSH 和T-AOC 指标的变化来反映机体受到的氧化胁迫[28-29]，以此判断机体自由基代谢及细胞损伤情况。

SOD 是生物体内存在的一种抗氧化金属酶。本试验结果表明，低浓度处理组（0.23 mg/L）肝胰脏组织SOD 活力被诱导升高，24、48、72 h 时与对照组有显著性差异（P＜0.05），表明低浓度敌百虫不能抑制SOD 活性，符合“毒物兴奋效应”[30-31]。中高浓度各处理组（0.47，0.94，1.88，3.75，7.50，15.00 mg/L）SOD 活力在24、48 h 分别各自呈现逐渐升高；72、96 h，1.88 mg/L 处理组SOD 活力升高最为明显。可见，不同时间段不同浓度敌百虫胁迫对东北蝲蛄肝胰脏SOD 活力均有诱导作用，在24、48 h 随着敌百虫胁迫时间的延长，自由基增多而诱导了SOD 的分泌；在短时间（24 h）内高浓度敌百虫会更快地激发SOD活性[19]；72、96 h，1.88 mg/L 处理组自由基可能增多的最高，这也是生物体通过诱导SOD 活性的升高与体内过量的活性氧自由基达成一种新的平衡，以此抵御外界毒物对机体的影响。中低浓度各处理组（0.23，0.47，0.94 mg/L）SOD 活力随着胁迫时间的延长分别各自呈现先升高再降低，有研究证实，当水生生物体受到长时间胁迫时，SOD 活性会降低[14]，表明随胁迫时间的延长，该中低浓度敌百虫胁迫可能使东北蝲蛄抗氧化能力受到一定抑制，未能及时清除的活性氧自由基会使机体产生氧化损伤。

CAT 在减轻活性氧自由基对机体细胞的氧化损伤方面起重要作用[32]，是虾蟹类重要的免疫因子。本研究结果显示，在整个试验过程中，中低浓度各处理组（0.23，0.47，1.88 mg/L）CAT 活力随着胁迫时间的延长分别各自呈现先升高再降低，中浓度处理组（0.94 mg/L）CAT 活力随着胁迫时间的延长呈降低趋势。先升高，表明东北蝲蛄体内活性氧原本平衡的状态被外源敌百虫的进入所破坏，为保持体内的平衡，受刺激的机体会产生一些自主的氧化应激反应，其可通过提高CAT 活性应对中低浓度敌百虫胁迫，有助于清除过量的H2O2；降低，原因可能是随着胁迫时间的延长，当机体内的毒物浓度超过东北蝲蛄的耐受能力范围，机体的正常代谢就会受到影响，对机体造成一定程度的氧化损伤，导致CAT 活性下降[32]。高浓度处理组（15.00 mg/L）CAT 活力均低于同一时间段其它各浓度组的CAT 活力，表明高浓度敌百虫对CAT 活性的抑制程度更强，这与有关研究结论相符[19]。

有研究表明，生物体内脂质过氧化水平能通过测定组织中MDA 含量反映出来，从而细胞氧化损伤情况和程度能被间接反映出来[28，33]。本试验结果表明，在整个试验过程中，中低浓度处理组（0.23，0.47，0.94，1.88，3.75 mg/L）与对照组均无显著性差异（P＞0.05）。这可能是由于在胁迫初期机体立即启动自身的应激防御系统，诱导SOD、CAT 活性升高，抵御敌百虫诱发产生的活性氧自由基，应激时抗氧化酶能够清理产生的活性氧自由基，从而阻止MDA 快速大量生成，避免因毒物入侵造成氧化损伤。本研究表明，在整个试验过程中，高浓度处理组（15.00 mg/L）MDA含量则显著高于对照组（P＜0.05）；在试验结束时（96 h），高浓度处理组（15.00 mg/L）MDA 含量高出对照组49.9%（P＜0.05）。这可能是由于高浓度敌百虫对东北蝲蛄的抗氧化系统产生了一定影响，SOD、CAT 活性被抑制，体内产生大量氧自由基，未能被及时清理，造成肝胰脏氧化损伤，导致脂质过氧化反应加剧，MDA 含量增加。

所有器官组织细胞内均能生成GSH，以肝脏内最为重要[29]。GSH 能直接与自由基反应，使机体抗应激能力有效提高，降低机体应激反应，起到抗氧化防御作用。GSH 能显著提高凡纳滨对虾、皱纹盘鲍肝胰脏中抗氧化酶活性以及总抗氧化能力[34]。肝脏中GSH 含量的变化对敌百虫引起的损伤反应灵敏且发挥了重要作用，对毒性反应灵敏且迅速[35]。本研究在24 h 短时间内，敌百虫胁迫中浓度处理组（0.47，0.94，1.88，3.75 mg/L）与对照组相比便显著降低（P＜0.05）；48、72、96 h，与对照组相比，同一时间段不同浓度东北蝲蛄肝胰脏GSH 含量表现为显著性降低（P＜0.05）。可能是由于机体消耗体内GSH 来抵御敌百虫胁迫引起东北蝲蛄体内脂质过氧化物及过氧化氢堆积的原因[36]。此外，随敌百虫胁迫时间的延长，各时间段对照组GSH 含量呈现下降趋势；在试验结束时（96 h），对照组GSH 含量仍显著高于同时间段各敌百虫胁迫组GSH 含量（P＜0.05）。GSH 含量减少可能与细胞对污染物及其代谢物解毒能力的饱和作用有关[29]。机体被敌百虫胁迫时间越长，受损伤程度越严重。衡量机体抗氧化能力大小的重要因素是GSH 含量的多少，缺乏或耗竭GSH会促使很多化学物质或环境因素产生中毒作用或加重中毒作用[37]。同时，也说明随着时间的延长，正常水体环境中的东北蝲蛄自身体内的GSH 含量也可能会减少。

T-AOC 是指各种抗氧化酶和抗氧化物质等构成的总抗氧化水平，是衡量机体抗氧化酶系统和非酶促系统功能状况的综合性指标，能代表、反映机体抗氧化酶系统和非酶系统对外来刺激的代偿能力及机体自由基代谢的状态[38]。为保护细胞和机体免受氧化应激损伤，可用T-AOC 来评价生物活性物质的抗氧化能力。本试验结果显示，低浓度处理组（0.23 mg/L）肝胰脏组织T-AOC 水平被诱导升高，表明低浓度敌百虫胁迫可能对东北蝲蛄的抗氧化防御功能起促进作用。本研究结果表明，中浓度处理组（0.47，0.94，1.88，3.75 mg/L）T-AOC 水平在24、48、72 h 时分别各自呈现逐渐升高；在试验结束时（96 h），高浓度处理组（15.00 mg/L）T-AOC 水平与对照组相比显著升高67.8%（P＜0.05）。可见，不同时间段不同浓度敌百虫胁迫对东北蝲蛄肝胰脏T-AOC 水平均有诱导作用。表明随着敌百虫胁迫时间的延长，显著激活了东北蝲蛄机体自身抗氧化防御系统，肝胰脏仍有抗氧化物质储备或产生，肝胰脏为抗敌百虫毒性作用的重要器官[39]，也表明机体抗氧化能力会通过自我调整来应对毒性胁迫作用。通过本研究结果显示，T-AOC 水平的升高可能是由抗氧化酶活性的提高引起，而并非通过调动机体的非酶促系统来完成。

综上，高浓度敌百虫胁迫通过影响肝胰脏组织结构，使肝胰脏生理功能受到抑制，从而威胁到东北蝲蛄的生存，证实了东北蝲蛄资源的减少与农药使用有关。东北蝲蛄对敌百虫敏感，可作为水环境中有机磷农药类污染的生物标志物。敌百虫胁迫下东北蝲蛄各组织酶活性的变化，反映了东北蝲蛄在不同时间段对不同浓度敌百虫污染的响应，对此种诱导或抑制酶活性的机理仍需进一步探讨。