不同促根剂对烟苗根系发育和氮代谢的影响

刘威 段史江 曾宇 韩助君 程小强 彭玉富 贾世伟 陈小龙

摘要：研究不同促根剂对移栽后烟苗生长、根系发育和根系氮代谢的影响，确定利于烟苗生长和根系发育的促根剂。以烤烟品种云烟87为试验材料，采用盆栽试验，设置对照、黄腐酸钾、生物炭、高碳基肥4个处理，分析不同促根剂对移栽后烟苗和根系的生长发育、根系氮代谢相关酶的影响，通过实时定量PCR研究不同促根剂处理下烤烟根系氮代谢相关基因的表达模式。比较分析不同促根剂的烟苗长势、根系参数和活力发现，生物炭的促苗生根效果最好，高碳基肥次之，黄腐酸钾效果最差；测定根系中硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、亚硝酸还原酶（NiR）和谷氨酸脱氢酶（GDH）的活性，4种酶活性排序为生物炭＞高碳基肥＞黄腐酸钾＞对照。根系氮代谢相关基因表达模式的分析表明，NR、GS、NIR3这3个基因的表达模式与上述的表型和氮代谢酶活性变化趋势相同；根系氮代谢关键酶活性与相应基因表达量的相关性分析表明，NR、GS、NIR3这3个基因分别是调控NR活性、GS活性和NiR活性的关键基因，这些基因的表达水平与对应酶活性存在正相关性。生物炭对促进移栽后烟苗的生长发育效果最好，高碳基肥效果次之，NR、GS、NIR3是调控根系氮代谢酶活性的关键基因。

关键词：烤烟；促根剂；氮代谢；酶活性；基因表达

中图分类号：S572.01 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）15-0093-07

基金项目：江西省烟草公司吉安市公司资助项目（编号：202136080027195）。

作者简介：刘 威（1999—），男，河南许昌人，硕士研究生，研究方向为烟叶调制。E-mail：liuwei99111@163.com。

通信作者：陈小龙，博士，农艺师，主要从事烟叶原料研究。E-mail：cxlong119@163.com。

移栽后烟苗的早生快发有利于提高烟苗的成活率，提早进入并相对延长旺长期，增加旺长期干物质的积累，进而影响到烟叶产质量的提升［1-3］。根系对于烟株水分和养分吸收起到重要的作用。烟株的正常生长、养分吸收、烟叶合成和积累有机物以及产质量与烟株根系发育的情况有着很大的关系［4-5］。烟苗移栽后促進烟株根系的快速生长对于烟株早生快发具有十分重要的意义。

氮代谢作为烤烟植株基本的生理代谢过程，也是烟叶品质形成的核心代谢途径。烟草氮代谢包括有机含氮化合物的转化、合成以及无机氮（硝态氮）的还原、同化等过程［6］。烤烟烟叶化学成分的含量及组成比例、产量和品质的形成与氮代谢的强度以及动态变化有关［7-9］。氮代谢相关基因的表达直接受到土壤营养的调控，因此，根系氮代谢调控是移栽后烟苗早生快发的关键。

植物通过根系细胞膜上的氮转运蛋白吸收土壤中的氮素并输送到体内［10］。硝酸还原酶（nitrate reductase，简称NR）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthase，简称GS）、亚硝酸还原酶（nitrite reductase，简称NiR）和谷氨酸脱氢酶（GDH）等酶类在高等植物的氮代谢中起着重要的作用，各种酶活性调控的相关基因已经被陆续鉴定［11-14］。

目前在烟草的栽培中，施用肥料仍然是促进烟株根系生长和提升烤烟品质的重要方式。烟草专用高碳基肥富含多种对烟草生长有利的营养元素，具有改善土壤微生态系统的作用以及无污染等优点［15-17］。生物炭具有化学性质稳定、吸附性强、孔隙度和比表面积较高等特点［18-19］，可被用于改善土壤理化性状，提高作物产质量等，增施适量的生物炭对于提高烟株根系的生长和烟叶质量具有较好的效果［20-23］。黄腐酸钾中的有机成分可以有效地提高土壤的有效氮供应量，根系对氮素、水分等的吸收利用得到提升，促进烤烟植株的根系生长，改善烟叶品质，提高烟叶产量［24-26］。

本研究以云烟87为试验材料，比较高碳基肥、生物炭、黄腐酸钾3种促根剂对根系生长发育、根系氮代谢相关酶活性和氮代谢基因表达量的影响，以期能够更好地促进烟株生长发育，为烤烟优质栽培提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烤烟品种为云烟 87。盆栽试验土壤来自江西吉安永丰县，土壤类型为水稻土，挖取0～20 cm 的耕层土壤充分混合后进行盆栽试验。土壤基本理化性质：有机质含量为33.68 g/kg，土壤水解性氮含量为134.59 mg/kg，有效磷含量为 26.37 mg/kg，速效钾含量为115.8 mg/kg，pH值为5.87。试验所用促根剂为高碳基肥、生物炭（烟草行业烟草栽培国家重点实验室/河南省生物炭工程技术研究中心），黄腐酸钾（郑州银之海化工产品有限公司）。盆钵规格：盆面直径20.49 cm，盆底直径11.00 cm，盆高11.20 cm，每盆装入风干土1.57 kg。

1.2 试验设计

试验于2021年9月在河南农业大学进行。云烟87种子播种在育苗盘中进行漂浮育苗，3周后进行盆栽，试验共设置4个处理（包括CK处理），每个处理3次重复。设置对照（CK），即不加促根剂处理；T1为黄腐酸钾处理；T2为生物炭处理；T3为高碳基肥处理。

T1处理按照肥 ∶水=1 ∶1 000（质量体积比）的比例于移栽当天浇灌在烟苗根系周围；T2和T3处理分别按照促根剂：土壤为2 ∶100和1 ∶100（质量比）的比例混匀后进行移栽和封窖处理。同时CK及T2和T3处理浇灌 400 mL水/株，以保证试验的一致性。盆栽置于光照度2 000 lx、16 h/8 h明/暗光周期、26 ℃条件的光照培养室培养。移栽后每隔10 d浇1次水，共3次，每盆浇水量为300 mL。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 农艺性状测定 烟株的农艺性状测定采用烟草行业标准YC/T 142—2010《烟草农艺性状调查方法》方法进行［27］。移栽后30 d将对照及每个处理的根、叶分开，用水把根上的土冲洗干净，在105 ℃的条件下杀青 30 min，用70 ℃烘至恒质量，对根干质量和叶干质量分别进行称量。烟叶SPAD值的测定利用日本柯尼卡美能达公司便携式叶绿素仪（SPAD 502型）进行。利用WinRHIZO根系分析软件统计总根长、根表面积、根体积和根平均直径。采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定根系活力［28］。

1.3.2 烟株根系氮代谢酶活性测定 采用试剂盒测定，各称取0.1 g新鲜根系，洗净并用滤纸吸干，放入含有提取液的研钵中，冰浴研磨，进行离心，取上清液置于冰上待测。将分光光度计预热，调节测定各个酶符合的波长，蒸馏水调零。测定吸光度，分别计算硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS，又称为N素转移酶）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酸脱氢酶（GDH）的活性。

1.3.3 q-PCR分析 烟草根部总RNA采用Trizol法进行提取，用M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒进行cDNA合成。在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中搜索烤烟氮同化途径（图1）中的关键酶——硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、亚硝酸还原酶（NIR）和谷氨酸脱氢酶（GDH）的基因编码序列，利用Primer 5.0软件在基因保守域设计q-PCR引物（表1）。按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix说明书进行实验操作，试验结果采用 2-ΔΔCT公式计算每个基因的相对表达量［29］，以L25作为内参基因。

1.4 数据处理

使用Excel 2010对数据进行整理，运用SPSS 17.0软件对数据进行多重比较、方差分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同促根剂对烟苗生长发育的影响

烟苗移栽后30 d，比较不同促根剂中烟苗长势，结果显示，不同土壤促根剂处理的烟株生长状态不同，其中T2处理的烟苗长势最好，T3次之，T1和CK长势最差（图2）。由表2可见，T2的最大叶长、最大叶宽和地上部干物质含量均显著高于CK、T1、T3，而CK、T1、T3这3个处理之间差异不大。在叶片SPAD值方面，各处理的差异不明显。促根剂处理可在不同程度上增加烟株的根冠比，其中T2处理效果最为显著。可见，生物炭（T2）处理对烤烟叶长、叶宽、SPAD值、地上部干物质质量和根冠比的综合促进效果最好，高碳基肥效果次之，黄腐酸钾对烟苗促生早发的效果不明显。

2.2 不同促根剂对烤烟根系生长的影响

移栽后30 d，综合分析烟苗的根部参数和根系活力 结果显示 T2处理下烟苗根质量、 总根长、根表面积、根体积、平均直径和根系活力均显著高于CK和T1，根质量、 总根长、根表面积和根体积显著高于T3，而根系平均直径和根系活力和T3处理无明显差异（表3）。比较根系参数和活力发现，在土壤中添加生物炭能显著促进烟苗发育，高碳基肥次之，黄腐酸钾对幼苗期长势无明显促进作用。

2.3 不同促根剂对烟株根系氮代谢相关酶活性的影响

不同促根剂处理的烟株根系氮代谢相关酶NR、GS、NiR和GDH活性测定结果（图3）显示，与CK相比，各处理的NR、GS、NiR和GDH的活性均显著提高，其中酶活性最高的为T2处理，其次为T3处理，T1处理活性较低。综合来看，T2处理对于NR、GS、NiR和GDH这4种氮代谢相关酶的活性提升效果最为顯著，说明生物炭可以促进烟草根系氮代谢相关酶活性，增强氮代谢效率。

2.4 生物炭对烟株根系氮代谢关键基因表达的影响

分析不同促根剂处理下烟株根系氮代谢相关基因的表达量差异，结果表明，4种处理下根系氮代谢相关基因的表达模式不同；NR、GS和NIR3的表达量在T1、T2和T3中均高于CK，基因表达量从高到底依次为T2＞T3＞T1＞CK；4个处理中NIR1和NIR2基因的表达水平没有显著差别；4个处理中GDH基因的表达量从高到底依次为T3＞T2＞CK＞T1（图4）。总体来看，生物炭（T2）处理可以提高根系氮代谢关键基因的表达水平。

2.5 氮代谢相关酶活性与基因表达量的相关性分析

分析生物炭处理下根系氮代谢相关酶活性与根系氮代谢关键基因表达量的相关性发现，NR活性与NR基因表达量呈显著正相关关系（r=0.899，P<0.05）；GS活性与GS基因表达量呈显著正相关关系（r=0.944*，P<0.05）；NiR活性与NIR3基因表达量呈显著正相关关系 （r=0.947*，P<0.05）（表3）。NR基因与NIR1基因表达量之间呈显著正相关关系（r=0.933*，P<0.05），GDH基因与NIR3基因、GS基因表达量之间呈极显著正相关关系（r=0.998**、r=0.983**，P<0.01），GS基因与NIR3基因表达量之间呈极显著正相关关系（r=0.971**，P<0.01）。可见，移栽后烟苗根系中NR、GS、NiR活性可能受到NR基因、GS基因和NIR3基因的调控，与这些基因的表达水平存在相关性。

3 讨论与结论

在提升烟叶产量和品质当中施肥是重要的管理措施，合理施肥有利于促进烤烟生长发育，提高烟叶的产量和品质。烟草的叶长、叶宽和干物质积累量会受环境、土壤等因素的影响，其中施肥影响很大［31-33］。作物根系干物质的分配量可随着水、肥等外界环境条件的改变而改变［34-35］。烟叶品质的高低与叶绿素含量高低密切相关［36］，叶绿素含量可以用SPAD值来表示［37］，它们之间存在显著线性关系［38-39］。本研究发现，生物炭处理对烤烟叶长、叶宽、SPAD值、地上部干物质质量和根冠比的综合促进效果最好，高碳基肥效果次之，黄腐酸钾促进烟苗生长发育的效果不明显。可见，生物炭对烤烟根系对营养元素的吸收、利用和积累有促进作用。

根系对养分和水分的吸收受根系形态及其生理特性的影响，同时根系对于植物吸收养分和水分十分重要［40-41］。通过对根系参数和活力的比较分析发现，在土壤中添加生物炭能显著促进烟苗发育，高碳基肥次之，黄腐酸钾对幼苗期的长势无明显促进作用，与刘先良等的研究结果［42］相似。本研究结果显示，施用生物炭促进烟苗发育，提升了根系吸收利用养分，可能与土壤的通透性和根际的营养状况因施用了生物炭得到了改善有关。

氮代谢在烟草有机物的合成和转化以及生长过程中起着重要的作用［43］。NR、GS、NiR和GDH是高等植物氮代谢中十分重要的酶。NR在氮代谢中的作用是将NO-3转换成NO-2，有利于烟株的生长发育［44］；GS在谷氨酸合成循环中催化谷氨酸与NH3形成谷氨酰胺，GS与植物含氮化合物的新陈代谢也有一定的关系［45］；NiR在氮代谢中的作用主要是将NO-2转换成为NH+4，从而进一步被植物使用［46］；GDH参与谷氨酸的分解代谢，在NH+4积累时同化NH+4，在碳氮代谢中有着重要的作用［47-48］。本研究结果显示，生物炭处理的NR、GS和NIR3基因的相对表达水平均显著高于对照、黄腐酸钾和高碳基肥处理，与烟草根系氮代谢相关酶活性表现一致，推测移栽后烟苗根系中NR、GS、NiR活性可能受到NR基因、GS基因和NIR3基因的调控，与这些基因的表达水平存在相关性；4个处理的NIR1和NIR2這2个基因的相对表达量没有显著差别，推测这2个NIR家族中的基因可能表达不明显；而4个处理中GDH基因的表达量从高到低依次为高碳基肥＞生物炭＞CK＞黄腐酸钾，推测GDH基因的表达可能与生育时期、品种特性、器官和土壤养分的状况等有关。总体来看，生物炭处理可以提高根系氮代谢关键基因的表达水平和根系氮代谢相关酶活性，促进烟株根系的氮代谢。

综上所述，比较不同促根剂中移栽后烟苗和根系的生长发育发现，生物炭的效果最好，高碳基肥效果次之，黄腐酸钾对于烟苗的促生效果不显著。土壤中添加黄腐酸钾、高碳基肥和生物炭均能显著增加根系中氮代谢相关酶活，效果排序为生物炭＞高碳基肥＞黄腐酸钾＞CK。3种促根剂处理后根系氮代谢相关基因的表达量普遍上调，其中NR、GS和NIR3基因表达量从高到底依次为生物炭＞高碳基肥＞黄腐酸钾＞CK。NR、GS、NIR3这3个基因可能是调控NR酶活性、GS酶活性和NiR酶活性的关键基因，这些基因的表达水平与对应酶活性存在正相关性。

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