YTH基因家族在肾癌中的表达和预后价值

麦麦提江·阿布杜克热木 张瑞丽,阿不来提·买买提明 艾尼瓦尔·艾木都拉

新疆医科大学第一附属医院 新疆乌鲁木齐 830054

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿生殖系统常见的肿瘤之一,以高转移率和高死亡率以及高度异质性为临床特点的恶性肿瘤[1]。目前早期诊断和及时手术仍是局限期RCC主要的治疗方式。而对于局部晚期 RCC的治疗则以靶向和免疫治疗为主,但是其有效率低以及耐药性等问题导致预后较差[2]。因此,寻找RCC特异性的生物标志物和新的治疗靶点是精准治疗的关键。

n6 -甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修饰是哺乳动物细胞中最常见的内部mRNA调控方式。它是通过改变RNA结构或招募m6A“阅读器”蛋白来发挥其生物学功能,被认为与人类致癌相关的新靶点[3]。m6A“阅读器”蛋白含有一个进化保守的YTH(YT521-B同源)结构域,可以直接与m6A结合并通过调控pre-mRNA剪接、RNA输出,促进mRNA翻译或衰减来控制信使RNA (mRNA)的表达,参与肿瘤的增殖、耐药及预后等过程[4-5],但是YTH家族蛋白在肾癌方面的研究较少。 本文就通过对多种公共数据库的生物信息学分析,探索肾癌中YTH家族蛋白的表达、预后、生物学功能等,为肾癌治疗中的潜在作用提供新的依据。

1 资料与方法

1.1 利用ULCAN数据库平台分析表达差异。

1.2 利用Kaplan-Meierplotter数据库分析YTH基因的表达与肾癌患者预后间关系。

1.3 使用cBioPortal分析YTH基因改变频率和类型。

1.4 通过WebGestalt平台进行GO和KEGG富集分析。

1.5 从癌症基因组图谱(TCGA)数据库(https://portal.gdc.com)获得了肾癌的RNAseq数据(level3)和相应的临床信息并使用Spearman法分析相关性。

1.6 DiseaseMeth分析YTH基因在肾癌和正常组织中的甲基化水平。

2 结果

2.1 在肾癌中YTH基因的表达差异

UALCAN数据库平台分析YTH基因在肾癌中的表达差异。YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1在肾癌组织中相对低表达,YTHDC2则明显高表达(P<0.001),而YTHDF1mRNA在肾癌组织中的表达与邻近正常组织相比无明显差异(P<0.05)(见图1)。

注:YTH基因的mRNA表达差异(ULCAN),*P<0.05,***P<0.0001。图1 肾癌中YTH基因表达

2.2 YTH家族基因表达与肾癌患者预后间关系

通过Kaplan-Meier plotter分析YTH基因的表达与肾癌患者总的生存率(OS)和无复发生存率(RFS)之间的关系。结果显示:YTHDF2(P<0.01),YTHDF3(P<0.01),YTHDC1(P<0.01),YTHDC2(P<0.01)低表达的肾癌患者OS低于高表达群体(见图2A);YTHDF1(P<0.01),YTHDF2(P<0.05),YTHDF3的低达与肾癌患者较差的RFS显著相关(P<0.05)(见图2B)。上述结果提示,YTHDF2和YTHDF3是预测肾癌预后有一定的参考价值。

注:2A:YTH基因表达与肾癌患者的总体生存率(OS);2B:YTH基因的表达与肾癌患者的无复发生存率(RFS)。图2 YTH基因表达与肾癌患者生存预测(Kaplan-Meier plotter)

2.3 YTH基因在肾癌中的遗传学改变

遗传突变性是肾癌发病原因之一。本研究利用cBioPortal平台分析YTH基因在肾癌中突变频率和类型。结果提示YTD基因变异率有所差异,最高的是YTHDC2(占11%),YTHDF2基因变异率则YTH家族中最低(占0.4%)其他依次分别为0.7%(YTHDF1,YTHDC1),0.9%(YTHDF3)。448例肾癌患者中,YTH成员遗传变异率为13.6%(占61/448)(见图3A),主要遗传变异类型包括:基因扩增、基因缺失、截短突变,剪接突变和深度缺失等(见图3A)。YTHDF3与YTHDF1和YTHDF2有许多相似的靶点,58%的YTHDF3靶点被YTHDF1识别,60%被YTHDF2识别,这表明YTHDF3蛋白在共同靶点上具有潜在的协同作用。研究发现YTHDF3通过与YTHDF1相互作用促进靶mRNA的翻译[6]。本研究利用GEPIA2平台分析探索YTH基因间的关系。图3B提示YTHDF3和YTHDC2和YTHDC1之间关系较为密切。

注:3A:肾癌中YTH基因突变率 (cBioPortal);3B:YTH基因间的相互作用(GEPIA2) 。图3 YTH基因在肾癌中的变异及之间相关性

2.4 YTH基因相关分子的生物学功能分析

通过cBioPortal 数据库分析出91个相互作用基因,并利用Cytoscape平台进一步构建蛋白互作网络图(PPI),图 4A 显示YTH基因的功能密切相关基因有MPHOSPH8、RAD21、HNRNPDL、DDX46、CAND1和RAD21。WebGestalt平台GO分析提示YTH基因涉及生物调控、代谢、繁殖、细胞成分的组织、多细胞生物过程、发育过程、应激反应、多器官生物过程、细胞信息传递以及细胞定位等环节。细胞核、细胞浆、含蛋白质复合物、细胞支架、细胞膜、膜密封腔、内质网、内膜系统等细胞及细胞外成分中YTH相关基因高度富集。主要分子功能包括核酸,蛋白质和核苷酸的结合以及水解酶活性、离子结合等(见图 4B)。KEGG分析发现与YTH家族相关的信号通路有转化启动、mRNA代谢调控过程、基因表达转录调控,细胞酰胺代谢过程调控等(见图4C)。

注:4A:肾癌中YTH基因共享差异基因的PPI网络(cBioPortal,Cytoscape);4B:YTH家族相关的生物过程、细胞成分、分子功能 (WebGestalt);4C: YTH基因相关的信号通路(WebGestalt)。图4 YTH基因功能及通路富集分析

图5 YTH基因与肿瘤免疫细胞浸润的相关性

图6 GSDM基因各成员在肾癌组织和正常肾组织中的DNA甲基化水平分析 (DiseaseMeth),*P<0.05,***P<0.0001

2.5 YTH基因与肿瘤免疫细胞浸润的相关性

目前免疫治疗已成为肾癌主要的治疗方法,YTH基因是癌症免疫治疗的潜在新靶点。所以本研究利用TIMER 2.0数据库分析YTH基因与免疫细胞浸润的相关性。结果显示所有YTH基因的表达均与CD4+T细胞、内皮细胞的浸润呈显著性正相关,与NK细胞浸润呈负相关。除YTHDF1外,其余4个YTH基因与CD8+T细胞浸润呈正相关。YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3和YTHDC1与巨噬细胞浸润呈负相关。YTHDF2,YTHDF3与B细胞浸润呈显著性正相关。

2.6 肾癌中YTH基因的甲基化水平

本研究利用ULCAN数据库分析肾癌中YTH基因甲基化水平。结果发现:肾癌中YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3的甲基化水平明显高于正常肾组织,而YTHDC2甲基化水平则明显低正常组织。YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1在肾癌组织中的异常低表达和YTHDC2高表达均考虑与它们的甲基化调控机制有关。在肾癌组织YTHDF1甲基化程度明显高于正常组织,但是YTHDF1mRNA表达无显著性差异

3 讨论

N6甲基腺嘌呤(m6A)被认为是最普遍、最丰富和最保守的RNA内部修饰方式,但是关于RNA m6A甲基化和肿瘤生物学之间关的研究甚少。YTH基因作为重要的甲基“识别蛋白”,属于YT521-B同源结构域蛋白(YTH)的两个亚型,即含YTH结构域蛋白的YTHDF1/2/3和YTHDC1/2,其中YTHDF1/2位于哺乳动物细胞质中,YTHDC1/2位于体细胞的细胞核中[7]。

多项研究显示m6A甲基“识别蛋白”在人类癌症中发挥着关键作用,并有望成为治疗靶点。如:YTHDF2与胶质母细胞瘤密切相关[8],作为GSC特异性依赖识别蛋白,YTHDF2通过稳定MYC转录,调节GSC中的葡萄糖代谢。YTHDC1/m6A/MCM4/DNA复制轴在白血病发生中起着关键作用,敲除YTHDC1对AML细胞增殖有较强的抑制作用[9]。此外YTHDF1以m6A依赖的方式促进Wnt关键受体frizzled7 (FZD7)的翻译,导致Wnt/β-catenin通路过度激活,促进胃癌发生[10]。另外一项研究显示YTHDF1和YTHDF3对乳腺癌的预后分层和治疗靶点具有潜在的应用价值。YTHDF1和YTHDF3频繁扩增促进乳腺癌的进展,同时YTHDF1和YTHDF3过表达与乳腺癌患者不良预后相关[11]。肺癌方面,YTHDC2通过其识别m6A的YTH结构域与m6A修饰的SLC7A11 mRNA结合,抑制肺腺癌细胞的增殖和生长[12]。

上述一系列研究证实了YTH家族5个成员在不同肿瘤生物学过程中发挥的重要作用,但是在肾癌发病机制中的作用尚未明确。因此,本研究我们利用公共测序数据的生物信息学分析来进一步了解YTH家族基因在肾癌中的生物学作用。

本研究分析结果显示,肾癌中YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1mRNA低表达,考虑为抑癌基因,YTHDC2的表达在肾癌中显著升高,考虑具有肾癌致癌基因的潜力。肾癌中YTHDF2和YTHDF3的低表达患者总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)低于高表达患者,可以考虑为肾癌潜在的预后标志物,需要进一步实验验证,为其作为肾癌治疗的新靶点提供更多的试验依据。

本研究显示,肾癌中YTH相关基因总变异率为13.6%,其中,变异幅度最高的为YTHDC2(占11%)。基因扩增为主要遗传变异类型,YTH基因主要的癌症相关功能为生物合成及分解代谢。功能富集分析发现YTH蛋白主要涉及生物调控和代谢等过程。肾癌作为异质性明显的肿瘤,具有明确的组织学和基因学改变,所以不同的患者对治疗有不同的反应。肾癌发生相关基因(VHL、FLCN、TFE3、FH或SDHB)的突变会导致对氧、铁、营养或能量水平变化的失控,这进一步证实肾癌是一种代谢改变驱动的癌症[13]。用GeneMANIA和激酶BCR、MIR-202 (ATAGGAA)相关基因构建的PPI网络表明,这些基因集主要负责凋亡信号通路和负生长调节。比如YTHDF2通过BCR激酶和MIR-202参与凋亡信号通路,负向调控生长,说明YTH家族蛋白通过影响mRNA代谢、基因表达转录、细胞酰胺代谢等生物学过程,调控肾癌的发生和发展[14]。本研究GO富集分析结果也证实,YTH家族基因大多与RNA代谢通路或细胞生物学功能相关。

RNA甲基化及其下游相关信号通路参与众多的生物学过程。研究报道基因的甲基化状态与其表达之间存在负调控关系[17]。比如:胃癌中多功能蛋白聚糖基因(VCAN基因)的甲基化状态与VCAN表达之间存在负调控关系[18]。食胃结合部腺癌(adenocarcinomas of the esophagogastric junction,AEG)Caveolin-1基因CpG岛的甲基化水平与该基因的低表达有关[19]。因此,RNA甲基化可能作为癌症诊断和个性化治疗的预测性生物标志物。本研究结果提示,YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1和YTHDC2在肾癌组织中异常表达可能与它们不同的甲基化水平有关。

综上所述,本研究发现YTH基因家族(尤其是YTHDF2、YTHDF3)在肾癌中差异表达并与预后有关,考虑为肾癌检测分子靶点和药物靶标提供了理论依据和线索。