HBeAg阳性及阴性乙肝患者血清HBV RNA与HBV DNA和转氨酶水平变化的相关性分析*

刘小花,蒋 萍,连 颖,余 杨,王桂香,何 幸,蒋华英,陈 涛

成都市新都区人民医院医学检验科,四川成都 610500

乙型病毒性肝炎是一种由乙型肝炎病毒(HBV)引起的肝炎病毒感染,主要以肝脏病变为主,可经血液传播、性传播和母婴垂直传播,病毒主要感染肝细胞,是一种容易变异的DNA病毒[1]。乙型肝炎(简称乙肝)常分为急性和慢性两种,急性乙肝患者一般经过1～3个月就能彻底清除体内病毒,同时其肝功能也随之恢复正常。慢性乙肝患者体内病毒难以清除,同时伴有肝功能异常反复,病毒核酸呈阳性,病程长,反复发作,难以痊愈,慢性感染可以持续多年或终身,而且常常没有明显症状。HBV感染呈世界性流行,它可以导致肝炎、肝硬化、肝癌等严重健康问题[2]。据统计,我国人群中乙肝患者达8千万人,全世界乙肝患者超过20亿人,全球约有2亿人感染HBV并有60万人死于HBV相关的肝炎或肝癌,HBV感染已经成为全世界人共同关注的问题[3-4],现有的抗病毒治疗药物难以在短期内达到治疗乙肝的效果。

研究发现,共价闭合环状DNA分子(cccDNA)是HBV的复制中间体,与HBV复制密切相关,HBV颗粒进入机体后,脱去衣壳,在相关酶的催化下,形成环状双链DNA,进而转录形成病毒前基因组(pgRNA),HBV pgRNA是cccDNA的直接转录体,其值可以准确反映体内共价闭合环状DNA分子的水平[5-6]。血清中的HBV RNA多来自于未逆转录的pgRNA,故肝脏中HBV RNA直接来源于cccDNA转录,其水平可以反映cccDNA的转录活性及转录水平[7]。研究表明,HBV pgRNA是乙肝E抗原(HBeAg)的翻译模板,故二者表达水平具有一定相关性,在HBeAg阳性的乙肝患者中,HBV RNA水平与肝脏中HBV cccDNA水平呈正相关[8]。血清中HBV RNA水平能够反映乙肝患者抗病毒治疗后的治疗效果、预测NAs治疗停药后的复发情况。

近年来,临床上多采用血清学、病毒学方法检测患者HBV复制情况,血清学检测多采用乙肝两对半[9],其中HBeAg是HBV在体内复制过程中产生的抗原,HBeAg检测是评估HBV感染活动性和繁殖能力的一种手段。对于急性乙肝,大多数患者可以通过充分的支持治疗恢复;如若HBeAg持续阳性3个月以上可能发展为慢性乙肝,慢性乙肝患者当前主要治疗方法包括抗病毒治疗和免疫修复治疗[10]。转氨酶主要存在于患者肝细胞内,是常规的肝功能指标,主要包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST),ALT和AST是评估乙肝早期肝细胞损伤的更加敏感的指标,其水平增高往往是乙肝早期最早的提示。HBV DNA水平是直接检测HBV在体内复制情况的指标,也是反映病毒繁殖活跃度的关键指标,常常采用分子生物学技术进行检测。HBV RNA可以反映病毒感染的活跃度、繁殖程度及患者的治疗效果等,在乙肝表面抗原(HBsAg)、HBeAg和HBV DNA病毒载量等指标受到干扰的情况下,HBV RNA可以提供更敏感和准确的HBV感染活跃度评估[11]。为此,HBV RNA成为了近几年临床上治疗乙肝的试验热点。本次研究通过分析HBeAg阳性及阴性的乙肝患者体内HBV RNA水平、HBV DNA水平、转氨酶(ALT和AST)水平,探讨HBV RNA与HBV DNA和转氨酶水平之间的变化关系,研究其对于乙肝患者临床诊断临床价值,为临床诊断和治疗乙肝患者提供新的检测方向,进一步治疗和预防HBV感染。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2022年11月至2023年4月在本院门诊及住院部就诊的乙肝患者共108例,其中HBeAg阳性患者25例,男17例,女8例,平均年龄(48.17±9.02)岁;HBeAg阴性患者83例,男53例,女30例,平均年龄(48.15±9.11)岁。两组患者性别和年龄差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。纳入标准:(1)诊断满足临床乙肝患者诊断标准,其中HBeAg阳性乙肝指患者血清HBsAg阳性、HBeAg阳性,伴有ALT持续或反复异常或肝组织学检查有明显炎症坏死;HBeAg阴性乙肝指患者血清HBsAg阳性、HBeAg持续阴性,多同时伴有乙肝E抗体阳性,伴有ALT持续或反复异常或肝组织学检查有明显炎症坏死[12];(2)准备接受或正在接受乙肝NAs治疗的患者。排除标准:(1)肝功能损伤;(2)肝细胞癌;(3)自身免疫性肝病或肝细胞代谢异常;(4)其他不适于纳入以上各组情况。本研究符合伦理标准,经本院医学伦理委员会批准,并签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 HBV RNA检测采用全自动核酸检测分析系统(AutoSAT),试剂盒由上海仁度生物科技股份有限公司提供;HBV DNA检测采用SLAN-96P全自动医用PCR分析系统,试剂盒由湖南圣湘生物科技有限公司提供;AST、ALT检测测定采用贝克曼库尔特AU生化分析系统,试剂盒由美国贝克曼生物科技有限公司提供;HBeAg检测采用i3000全自动化学发光免疫分析仪,试剂盒由四川迈克生物科技股份有限公司提供,严格按照试剂说明书进行操作。

1.3方法

1.3.1HBV RNA检测 首先取250 μL待测血清样本与病毒核酸提取液进行混合;置于60 ℃下孵育10 min;待其室温冷却之后进行杂交捕获;吸附于磁珠上后弃除多余废液;使用洗涤液清洗磁珠;将含有纯净RNA靶标的磁珠颗粒放入有扩增检测液1、2及酶液组成的扩增体系中,42 ℃反应40 min;采用实时荧光核酸恒温扩增技术检测。HBV RNA检测下限为100 copies/mL,HBV RNA阴性为HBV RNA<100 copies/mL。

1.3.2HBV DNA检测 根据待测样本、阴性、阳性对照以及参考品,按比例配制混匀成PCR混合液,瞬时离心以备用;样本释放剂提取样本核酸;每管各加入40 μL PCR混合液,离心30 s;采用实时荧光定量PCR技术定量检测。HBV DNA检测下限为500 IU/mL,HBV DNA阴性为HBV DNA<500 IU/mL。

1.3.3HBeAg和AST、ALT检测 HBeAg检测方法为化学发光法,AST、ALT检测方法为双试剂速率法,计算各样本中AST、ALT水平,检测均在仪器维护、校准、质量控制完成后进行检测。

2 结 果

2.1两组乙肝患者HBV RNA、HBV DNA与ALT、AST表达水平比较 HBeAg阳性组乙肝患者HBV RNA、HBV DNA以及ALT、AST水平表达明显高于HBeAg阴性组乙肝患者(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者HBV RNA、HBV DNA与ALT、AST表达水平比较

2.2两组乙肝患者HBV RNA与HBV DNA和ALT、AST的相关性分析 HBeAg阳性乙肝患者中,HBV DNA表达与HBV RNA表达呈正相关(r=0.424,P<0.05);ALT、AST水平与HBV RNA表达无相关性(P>0.05)。

HBeAg阴性乙肝患者中,HBV DNA表达与HBV RNA表达呈正相关(r=0.461,P<0.05);ALT、AST水平与HBV RNA表达无相关性(P>0.05)。

2.3两组乙肝患者HBV RNA、HBV DNA表达情况比较 HBeAg阳性组HBV RNA阳性率和HBV DNA阳性率与HBeAg阴性组比较,差异均有统计学意义(P<0.001)。见表2。

表2 两组患者HBV RNA和HBV DNA表达情况比较[n(%)]

3 讨 论

慢性HBV感染是一个主要的公共卫生问题,全球约有2.4亿慢性HBV感染者[13-14],由于HBV cccDNA的持续存在,即HBV RNA的真正转录模板,会导致病毒抗原如HBeAg和HBsAg及子代病毒的产生。对于HBV感染者的抗病毒治疗只能达到对病毒的抑制作用,而不能彻底清除病毒[15]。目前,临床上还不能将肝内HBV cccDNA检测作为常规诊断方法,因此有必要开发非侵入性的替代标志物来监测HBV cccDNA的数量或活性。在过去,一些血清学标志物,包括HBV DNA、HBsAg和乙肝核心相关抗原等几种血清学标志物已被证明与乙肝的关联性[16-17]。最近,血清HBV RNA已被认为是评估HBV cccDNA的一个新的生物标志物,乙肝患者血清中HBV RNA转阴可能意味着患者肝细胞内HBV cccDNA的清除或转录活性的沉默,也可能提示乙肝患者可以在实现临床治愈之前,安全地停用NAs抗病毒治疗[18]。

本研究通过分析HBeAg阳性和阴性乙肝患者血清HBV RNA与HBV DNA和转氨酶表达水平的变化发现,HBeAg阳性组HBV RNA、HBV DNA和ALT、AST表达水平明显高于HBeAg阴性组(P<0.05),与其他学者的研究结果一致[6,19];同时两组乙肝患者HBV RNA表达水平与HBV DNA表达水平均呈正相关(P<0.05)。张荣芳等[20]发现,乙肝患者HBV RNA与HBV DNA在治疗前和治疗初期有明显相关性[20]。罗小露等[21]发现,在乙肝患者HBeAg血清学转变期,HBV RNA表达水平与HBV DNA表达水平在反映病毒复制活跃性方面具有一致性,在病毒活跃性高的时期,HBV RNA和HBV DNA的相关性更高;当对乙肝患者采用NAs抗病毒治疗后,二者的相关性可能会发生变化。在临床实践中,HBV RNA有助于更准确地评估病毒复制水平和预测治疗效果,与本研究结果一致。

本研究发现,HBeAg阳性组HBV RNA、HBV DNA阳性率与HBeAg阴性组比较差异均有统计学意义(P<0.001)。乙肝感染分为两期,复制期和非复制期,当HBeAg出现血清学转变,由阳性转变为阴性之后,HBV会随之停止复制[22]。并且由于蛋白质的半衰期比DNA长,故当HBV DNA被抑制或减弱消失时,HBeAg仍可存在一定的时间,故有些乙肝患者HBeAg表达阳性,但是其HBV DNA表达阴性。当HBeAg表达由阳性转为阴性时,HBV cccDNA仍然可以逆转录形成HBV RNA,提示HBV RNA比HBV DNA更能准确反映HBeAg转阴的情况[23];有文献报道,在接受治疗的乙肝患者中,HBV DNA均低于检测下限的患者中发现有35例HBV RNA呈阳性,提示HBV RNA比HBV DNA更能准确反应病毒的存在状态。[24]。HBV DNA阳性可以判别乙肝患者或者携带者传染性情况,通过定期HBV DNA定量检测,可判断HBV的增长、临床病情是否稳定,还可直接监测抗病毒治疗的疗效[25]。研究表明,HBV RNA可以反映乙肝患者体内HBV cccDNA的转录活性,也是反映HBV感染活跃度的另一重要指标,此外,HBV RNA对于乙肝患者在抗病毒治疗后的疗效监测、预测疾病转归等方面具有重要意义[26-27],ALT、AST是能够及时反映肝脏发生不同程度实质性病变的关键指标[28]。

综上所述,HBeAg阳性乙肝患者与HBeAg阴性乙肝患者的HBV RNA、HBV DNA和转氨酶表达水平存在明显差异,部分HBV DNA阴性乙肝患者,HBV RNA检测为阳性,因此,可以常规开展HBV RNA检测,为早期诊断、病变程度及临床治疗指导等提供诊断依据。