IGFALS基因多态性与特发性矮小症患儿rHGH治疗效果及血清IGF-1水平的关系*

彭丽琨,何大可,张翠香,杨巨品,严家威,董宇莹,江 泳,黄张杨,段丽梅

1.大理白族自治州人民医院儿科三病区,云南大理 671000;2.上海交通大学附属新华儿童医院小儿神经内科,上海 200127

特发性矮小症(ISS)是指一种生长激素正常,不伴有潜在病理状态的身材矮小,约占儿童矮小症的60%～80%[1]。目前ISS发病机制尚不明确,可能与遗传、营养不良、对生长激素不敏感等多种因素有关。重组人生长激素(rHGH)是可促进骨骼肌肉生长、调节内分泌激素水平的药物,目前在ISS治疗中取得了一定效果[2]。但rHGH疗效在不同患儿中差异较大,提高rHGH治疗敏感性一直是临床医师关注的重点问题。相关研究显示,rHGH治疗效果可能与治疗时间、初始身高、骨龄等临床特征有关[3]。随着分子生物学及检测技术的发展,基因多态性与ISS相关性报道逐渐增多。胰岛素样生长因子不稳定亚单位(IGFALS)基因位于人体16号染色体上,其表型变化可引发机体生长发育迟缓,还有研究显示,IGFALS基因突变可表现为血清胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的表达异常[4-5]。目前关于IGFALS基因多态性在ISS发病及疗效中研究较少,本次通过分析120例ISS患儿IGFALS基因多态性与rHGH疗效、血清IGF-1表达的关系,为探讨ISS发病机制和指导个体化治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2021年1月至2022年8月大理白族自治州人民医院收治的120例ISS患儿作为ISS组。纳入标准:(1)确诊为ISS,参考第7版《诸福棠实用儿科学》[6],患儿身高在性别、年龄、种族等基本特征相似的情况下低于均值2个标准差;(2)年龄6～14岁;(3)患儿及家长能配合进行治疗和研究,rHGH治疗时间在12个月以上;(4)父母签署同意书。排除标准:(1)宫内生长迟缓、早产或先天畸形;(2)合并先天性心脏病、染色体疾病、内分泌失调、佝偻症、骨和软骨发育不全、情感障碍、营养不良等影响生长发育疾病或因素;(3)头颅MRI检查显示存在占位性病变。另选同期大理白族自治州人民医院体检健康儿童120例作为对照组,身高在相同年龄、性别、种族儿童的均值2个标准差范围内,体质量处于正常范围,无相关影响生长发育疾病。ISS组中,男67例,女53例;年龄6～14岁,平均(9.72±0.84)岁。对照组中,男62例,女58例;年龄6～13岁,平均(9.54±1.06)岁。两组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经大理白族自治州人民医院医学伦理委员会审核通过。

1.2基因测序方法 采集ISS组和对照组儿童空腹静脉血2 mL于抗凝管中,采用人全血DNA提取试剂盒(美国默克公司)提取总DNA后于-20 ℃备用。PCR扩增IGFALS基因rs767089671位点(上游:5′-TTGCCGCTGCAGACGTGGGCGATTT-3′,下游:3′-GCTGGGCTGGGGGAGTCTCTCATTA-5′),以提取的DNA为模板进行PCR扩增:95 ℃ 5 min预变性,94 ℃ 30 s变性,60 ℃ 30 s退火,65 ℃ 1 min(26个循环)延伸,65 ℃ 10 min,4 ℃保持。取出产物加入限制性内切酶在55 ℃保温箱中消化3 h,随后采用8%非变性SDS-PAGE进行电泳,硝酸银染色观察各区带基因分型结果。

1.3rHGH治疗 ISS组患儿均由父母或本人经过规范化培训在家中治疗,每晚睡觉前按患儿体质量在腹部、大腿或上臂注射0.1 U/kg rHGH,1次/天,连续治疗12个月。

1.4指标评价 收集两组儿童一般临床资料,包括性别、年龄、体质量、身高、遗传靶身高、骨龄,计算治疗前及治疗12个月后生长速率(GV)、骨龄(BV)。遗传靶身高=(父母身高均值-6)±4[7]。年龄对应身高标准差积分(HtSDS)=(测得身高-同性别年龄种族平均身高)/同性别年龄种族平均身高标准差[8];ΔHtSDS=治疗后HtSDS-治疗前HtSDS。采用酶联免疫吸附试验检测治疗前后患者血清胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)及IGF-1水平,试剂盒均购自武汉赛培生物科技有限公司。

2 结 果

2.1两组IGFALS基因多态性分布比较 ISS组和对照组IGFALS基因rs767089671位点的基因分型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),可反映一般儿童情况。ISS组IGFALS基因rs767089671(c.1310C>T)位点基因分型及C/T等位基因分布频率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),见表1、图1。

图1 患儿IGFALS基因rs767089671位点测序图

表1 两组IGFALS基因多态性分布比较(n)

2.2不同基因分型ISS患儿治疗前临床指标比较 治疗前IGFALS基因 rs767089671位点不同基因分型患儿性别、年龄、体质量、身高、遗传靶身高、骨龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 ISS患儿治疗前临床指标比较(n/n或

2.3不同基因分型ISS患儿rHGH治疗效果 治疗前IGFALS基因 rs767089671位点不同基因分型患儿GV、HtSDS比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后不同基因分型患儿GV、HtSDS均升高,且CC型患儿GV、HtSDS变化更明显(P<0.05),见表3。

表3 不同基因分型ISS患儿rHGH治疗效果

2.4不同基因分型ISS患儿rHGH治疗前后血清IGFBP-3、IGF-1比较 治疗前IGFALS基因 rs767089671位点不同基因分型患儿血清IGFBP-3、IGF-1水平比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后不同基因分型患儿血清IGFBP-3、IGF-1水平均升高,且CC型患儿IGFBP-3、IGF-1水平变化更明显(P<0.05)。见表4。

表4 不同基因分型ISS患儿rHGH治疗前后血清IGFBP-3、IGF-1水平比较

2.5血清IGF-1、IGFALS基因多态性与rHGH治疗效果关系 Spearman相关性分析显示,ISS患儿治疗前血清IGF-1、IGFALS基因多态性与ΔHtSDS均呈正相关(r=0.932、0.576,P<0.05)。

3 讨 论

ISS是一种未明确原因的体格发育迟缓,临床上未见明显生长激素(GH)不足或其他病理性变化,推测其发病可能是内外环境多种因素共同影响的复杂过程[9]。IGFALS是近年来发现的与机体生长发育密切相关的基因,其编码的糖蛋白能与体内IGF-1和IGFBP-3形成的二聚体结合,形成IGF系统;而IGFALS基因突变可导致IGF三聚体形成障碍,IGF-1和IGFBP-3被过快清除,GH无法正常发挥作用,最终导致生长发育迟缓[10-11]。有学者在1 034例ISS患儿中检出IGFALS基因突变的概率为9.6%～10.1%,而IGFALS对身高的影响与其能发生各种形式突变(错义、无义、缺失、重复、插入等)有关[12]。还有研究显示,IGFALS基因缺陷能通过影响IGF系统成分导致机体对GH敏感性下降,引发rHGH治疗效果不佳[13]。探究IGFALS基因突变与rHGH治疗效果对指导临床治疗具有重要意义。

本次研究检测了120例ISS患儿和健康儿童IGFALS基因p.S410L(rs767089671位点)表型突变情况,发现ISS组IGFALS基因rs767089671(c.1310C>T)位点基因分型及C/T等位基因分布频率与对照组比较存在明显差异,ISS患儿以CC型占比为主,TT型占比最低,与相关研究结果相符[14]。有学者检测了129例ISS患儿和131例身高正常健康儿童IGFALS外显子2基因多态性,发现其中存在大量同义突变和非同义突变,其中同义突变频率在两组中无明显差异,而包括rs767089671位点在内的非同义突变在ISS患儿中发生频率更高,提示该位点突变可能是诱发ISS发病的原因之一[15]。治疗12个月后,各基因分型患儿GV、HtSDS均明显改善,且CC型患儿变化更明显,提示rHGH疗效与IGFALS基因多态性有关。

IGF系统参与调节人体胚胎早期发育、生长、繁殖过程,IGFALS表达量及表型正常是IGF-1和IGFBP-3在血液中水平升高的前提条件,也是维持IGF系统成分和满足人体生长潜能的重要保证。有研究显示,ISS患儿中血清IGF-1和IGFBP-3水平下降,提示血液中IGF-1和IGFBP-3累积不足与ISS发病有关[16]。IGF-1参与的GH-IGF-1调节轴是调控机体生长发育的重要途径,其主要通过提高机体能量代谢水平并作用于GH来影响机体生长[17]。还有研究显示,敲除IGFALS基因会下调IGF-1在血清中的表达,最终引发骨获得障碍和生长迟缓,提示IGFALS基因表达与IGF-1表达密切相关[18]。本次研究结果显示,不同IGFALS基因分型ISS患儿rHGH治疗效果存在差异,推测IGFALS基因突变可能引发血清IGF-1水平下降,从而影响rHGH疗效。而治疗后不同基因分型血清IGF-1水平变化也证实了这一点。有学者纳入21例GH不敏感患儿,结果证实有2例存在IGFALS基因p.S410L杂合变异,且其发生概率较健康对照儿童高,提示IGFALS基因突变缺陷可能参与儿童GH不敏感和ISS发病过程[19]。也有研究显示,GH不敏感是引发IGF-1缺乏的重要原因,提示儿童生长发育不良与IGFALS基因缺陷和IGF-1表达下调密切相关[20]。Spearman相关性分析显示,患儿治疗前血清IGF-1、IGFALS基因多态性与治疗前后ΔHtSDS呈正相关,证实rHGH疗效与IGFALS基因突变和治疗前IGF-1水平有关,同时也提示ISS治疗时间越早,基础IGF-1水平越高,疗效越好。而临床工作中也可通过调整GH-IGF-1轴来改善rHGH治疗效果。

综上所述,ISS患儿IGFALS基因rs767089671位点基因突变与rHGH治疗效果及血清IGF-1表达有关,且CT和TT基因分型患儿rHGH治疗后GV增加没有CC基因分型患儿明显可能与血清IGF-1水平增加不足有关,该位点突变可作为评估rHGH治疗效果的参考指标,对临床治疗具有一定指导意义。