青刺尖油枯的化感作用及其化感物质的分析

谢庆玲, 刘 刚,2*, 夏 陈, 古春梅,赵甲元,2, 张义兰, 汪淑芳,2

(1. 四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610101; 2. 四川师范大学 乡村振兴与生态规划研究所, 四川 成都 610101;3. 四川省农业科学院 农产品加工研究所, 四川 成都 610101)

青刺尖(Prinsepiautilis)属蔷薇科扁核木属多年生的灌木,种子可以榨取食用油,又名打油果、牛奶捶、阿纳斯(纳西族)、出裸(彝族)和梅花刺等,为落叶灌木,丛生,株高1～5 m,生长于海拔1 000～3 000 m的山坡、溪边和荒地,雌雄同株,冬季开花,夏季结果,主要分布于云贵川、台湾和西藏等地[1-3].《云南天然药物图鉴》记载,性味苦、辛、凉,在《贵州中草药》《中药大辞典》《云南民族药志》中也有记载[4].《滇南本草》记载[5]:青刺尖“性微寒,味苦.攻一切疮毒痈疽”.其茎叶主治痈疽毒疮、风火牙痛、枪伤、骨折、蛇咬伤;根主治虚咳、久咳、积食、风湿性关节炎;果主治目翳多泪、消化不良等[6-7].近几年对青刺尖的研究发现,它有很高的经济价值[8]、药用价值[9-10]和营养价值[11],种子油有耐缺氧[12]、调节血脂[13]、抗脑缺氧[14]等功能,有很高的开发价值,但是,多数研究集中在保健功能.随着对青刺尖油脂的大规模利用,油枯等副产物的研究也需要加强.但是,青刺尖油枯的研究较少,如提取物对常见致病菌有不同程度的抑杀作用[15].

在前期研究青刺尖油脂的过程中[16],发现油枯中的挥发性物质对其他植物的生长有影响,但是,该现象尚未见文献报道,物质基础也未知.本研究以豌豆(Pisumsativum)和青稞(Hordeumvulgarevar.coelesteLinnaeus)这两种经济作物为材料,研究青刺尖油枯挥发物的化感作用,旨在了解其对植物生长的影响作用,为进一步综合开发与利用青刺尖奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器2020年9月于重庆市酉阳县采集黄花蒿,经鉴定符合黄花蒿(Artemisiaannua)的特征[17];青刺尖于2019年4月采自四川省阿坝州若尔盖县,经鉴定符合青刺尖(Prinsepiautilis)的特征[17],将油枯置于30 ℃烘20 min,粉碎过20目筛,冷藏备用[16].豌豆、青稞种子从种子公司购得.试剂和仪器:GC/MS(PerkinElmer)、烘箱、移液枪、透明干燥室(29 cm×19 cm×39 cm)、粉碎机.

1.2 试验方法

1.2.1效应植物的处理 分别选取饱满、均匀,且无病虫害的豌豆和青稞种子,质量分数0.5%高锰酸钾灭菌8 min,无菌水清洗3～5次,20 ℃浸泡24 h,青稞种子浸泡后置于4 ℃春化处理,得到吸胀种子.吸胀种子置于有双层无菌水浸润滤纸的Φ9 cm培养皿,适应条件萌发,得发芽种子.选取发芽一致的种子,分别播种到Φ10 cm花盆,每盆10粒,得到幼苗.

1.2.2试验设计 青刺尖果实含有多种萜类成分[18],由于气体挥发物量与油枯质量有密切关系,青刺尖油枯越多,单位体积中释放的气态挥发物质越多,浓度越高.本试验以单位体积的材料质量表示挥发物的质量浓度(g/cm3),实验称取一定质量的青刺尖油枯和阳性对照材料,放入29 cm×19 cm×39 cm透明方形容器,分别同时置入吸胀种子和幼苗.透明方形容器分别放入6.25、12.5、25、50和100 g青刺尖油枯,得到0、0.18、0.36、0.72、1.44和2.88 g/cm3质量浓度的处理结果,其中,0 g/cm3为阴性对照.以富含萜类具有明确的化感作用[18]的黄花蒿为阳性对照材料,将自然风干黄花蒿粉碎,过0.25 mm孔径筛,称取100 g放入1 000 mL蒸馏水,25 ℃浸提24 h,5 000 r/min离心15 min,取上清液,备用.每隔24 h,分别将前述效应材料放入透明方形容器,凡士林密封,光照处理30 min.每日记录实验材料的胚芽长度,每个处理重复3次.

1.2.3GC-MS的分析测定 取青刺尖油枯适量,蒸汽提取30 min,冷凝收集挥发物,再用配备DB-5 MS柱的AutoSystem XL GC/TurboMass MS分析(30 m×0.25 mm×0.25 μm)样品,温度60 ℃持续4 min,氦气作载气,以5 ℃/min速率升温至300 ℃,持续10 min,记录的质荷比为33～500m/z.利用NIST谱库检索实验获得质谱图中显现的挥发性物质,通过保留指数定性法验证质谱检索结果.

1.3 统计与分析用SPSS 20.0进行统计分析,组间比较用方差分析,差异显著再用LSD多重比较[19],指标用means±std表示;用SPSS的Probit回归法分别计算,挥发物对豌豆和青稞胚芽长度的IC50值[20].

2 结果与分析

2.1 青刺尖油枯气态挥发物处理对豌豆胚芽长度的影响按试验设计连续处理16 d,记录实验效应材料的胚芽长度,比较每间隔4 d豌豆胚芽长度的差异性,计算4 d累计平均胚芽长度,结果见表1.

表 1 处理16 d青刺尖油枯对豌豆幼苗胚芽长度的抑制作用(n=30)

从表1可看出,处理1 d,与阴性对照组比较,除0.72 g/cm3中质量浓度组的豌豆幼苗芽平均长度差异性不显著(P>0.05)外,其他处理组和阳性对照组的差异性都显著(P≤0.05);与阳性对照组比较,高、中质量浓度的处理组差异性不显著(P>0.05).处理4 d,与阴性对照组比较,除2.88 g/cm3的豌豆幼苗芽平均长度差异性不显著(P>0.05)外,各处理组和阳性对照组的4 d累计平均芽长度差异性都显著(P≤0.05);与阳性对照组比较,高质量浓度处理组的差异性不显著(P>0.05).处理8 d,与阴性对照组比较,各处理的差异性都显著(P≤0.05);与阳性对照组比较,高质量浓度的处理组差异性不显著(P>0.05).处理12 d,与阴性对照组比较,除低质量浓度处理的差异性不显著(P≤0.05)外,其他处理的差异性都显著(P≤0.05);与阳性对照组比较,高、中高和中质量浓度的处理组差异性都不显著(P>0.05).处理16 d,与阴性对照组比较,各处理组、阳性对照组的差异性显著(P≤0.05);与阳性对照组比较,高、中高和中质量浓度的处理组差异性都不显著(P>0.05).因此,用青刺尖油枯每日定时处理豌豆幼苗1～16 d,对豌豆幼苗的生长都有显著抑制作用,此与黄花蒿的抑制效应一样.

2.2 青刺尖油枯气态挥发物的质量浓度和处理时间对豌豆幼苗生长的影响以质量浓度为横坐标,分别以豌豆幼苗长度、日增加长度为纵坐标,得到连续处理1～16 d、不同质量浓度青刺尖油枯气态挥发物对豌豆幼苗影响的结果,见图1和图2.

图1 不同质量浓度青刺尖油枯对豌豆幼苗长度的影响

图2 不同质量浓度青刺尖油枯对豌豆幼苗日增加长度的影响

从图1可以看出,豌豆幼苗对青刺尖油枯气态挥发物较敏感.同一质量浓度条件下,随着处理时间的增加,各个质量浓度的青刺尖油枯都对豌豆幼苗的生长抑制作用逐渐增强,导致幼苗的生长缓慢.随着青刺尖油枯气态挥发物质量浓度的增加,处理相同时间的抑制曲线在0～1.44 g/cm3下降,但在1.44～2.88 g/cm3却稍有升高,但仍然低于初始值.与空白组比较,0.18～1.44 g/cm3的各个处理组,豌豆幼苗平均长度均达到极显著水平(P<0.01);而在1.44～2.88 g/cm3,1～10 d的处理没有显著差异,但是在11～16 d的处理有显著差异性(P≤0.05).因此,青刺尖油枯质量浓度为1.44 g/cm3时,对豌豆幼苗的抑制作用最强.

从图2可以看出,与空白组比较,各个青刺尖油枯的高低质量浓度处理组都对豌豆幼苗的日增加长度有显著的抑制作用(P≤0.05).在0.18～1.44 g/cm3与空白对照比较,各处理组的豌豆幼苗的日增加长度差异均达到极显著(P<0.01),质量浓度2.88 g/cm3时,各处理组的豌豆幼苗日增加长度差异不显著.因此,青刺尖油枯的质量浓度在1.44 g/cm3对豌豆幼苗日增加长度的抑制作用最强,质量浓度增大到2.88 g/cm3时没有显著差异,呈现抑制的饱和现象.

2.3 青刺尖油枯气态挥发物对豌豆种子芽伸长的影响处理时间为横坐标,分别以豌豆种子的芽长、日增长量为纵坐标,得到不同质量浓度青刺尖油枯处理对豌豆种子萌发的影响,16 d的结果如图3和图4所示.

图3 不同时间青刺尖油枯气态挥发物对豌豆种子芽长的影响

图4 不同时间青刺尖油枯气态挥发物对豌豆种子的芽长日增加量的影响

从图3可看出,青刺尖油枯气态挥发物浓度由低到高的变化过程中,豌豆种子的芽伸长随着处理时间的增加,均值呈现上升的趋势.处理1～4 d的曲线较平缓,即豌豆芽长增长较缓慢;处理4～16 d的曲线较陡,即豌豆芽长增长较快.分析比较同一处理时间曲线的变化,可以看出处理的浓度越高,曲线越低矮,呈现出对豌豆种子的芽伸长抑制现象.

从图4可以看出,阳性对照组第2天的日增加量为(0.48±0.49) cm,第9天的日增加量达到高峰,为(2.07±0.45) cm,第10天的日增加量明显下降,为(1.20±0.60) cm.1.44 mg/m3中高质量浓度组的日增加量最低,与其他组比较,差异极显著(P<0.01),第2天的日增加量为(0.78±0.40) cm,第9天的日增加量达到高峰,为(1.28±0.66) cm,第10天的日增加量明显下降,为(0.88±0.42) cm.因此,青刺尖油枯在1.44 mg/m3中高质量浓度时,对豌豆种子的芽伸长的日增加量抑制作用最强.

2.4 青刺尖油枯气态挥发物的处理浓度和处理时间对豌豆种子芽伸长的影响回归分析表明,青刺尖油枯不同处理质量浓度、不同处理时间,对豌豆种子的芽伸长有相关性.可建立“质量浓度、处理时间-芽伸长”方程,并得到方程的决定系数r2=0.734.

l豌豆=-0.802+0.777x+0.005y,

其中,l豌豆表示豌豆芽长(cm),x为提取物处理质量浓度(mg/cm3),y表示处理时间(d).从方程可知,豌豆种子的芽伸长量与青刺尖油枯的质量浓度呈极显著的正相关,即当处理质量浓度大于1.44 g/cm3时,处理质量浓度越大,豌豆芽长越短.但是,豌豆种子的芽伸长量与处理时间的相关性不高.

青刺尖油枯在不同质量浓度处理和不同处理时间,对豌豆种子的芽伸长日增加量有相关性.建立方程,得到方程的决定系数r2=0.162,此决定系数较低,因此,豌豆种子的芽伸长日增加量与青刺尖油枯质量浓度、处理时间的线性不显著.

2.5 青刺尖油枯气态挥发物对青稞幼苗生长的影响按试验方案连续处理16 d,比较每隔4 d,不同组的青刺尖油枯对青稞幼苗生长的影响,计算4 d累计平均芽长,结果见表2.

表 2 处理4 d青刺尖油枯对青稞幼苗生长的抑制作用(n=30)

从表2可看出,处理1 d青稞幼苗,与阴性对照组比较,除极低质量浓度组外,低、中、中高、高质量浓度和阳性对照的差异性都显著(P≤0.05);与阳性对照组比较,除极低质量浓度组外,低、中、中高、高质量浓度和阳性对照的差异性都不显著(P>0.05).处理4 d,与阴性对照组比较,除极低质量浓度处理外,其他处理4 d累计平均芽长的差异性都显著(P≤0.05);与阳性对照组比较,除极低、低、中高质量浓度组外,中、高质量浓度的差异性都不显著(P>0.05).处理8、12和16 d,分别与阴性对照组比较,各处理质量浓度和阳性对照的差异性都显著(P≤0.05);与阳性对照组比较,除中、中高质量浓度组外,其他处理质量浓度组的差异性都不显著(P>0.05).

因此,用青刺尖油枯每日间断处理青稞幼苗1～16 d,低质量浓度处理表现为抑制,高质量浓度表现为促进,而对芽生长的抑制作用,与黄花蒿的一样.

2.6 青刺尖油枯气态挥发物的质量浓度和处理时间对青稞幼苗生长的影响以质量浓度为横坐标,分别以青稞幼苗长度、日增加长度为纵坐标,得到连续处理1～16 d、不同质量浓度青刺尖油枯气态挥发物对青稞幼苗影响的结果,见图5和图6.

图5 不同质量浓度青刺尖油枯对青稞幼苗的影响

图6 不同质量浓度青刺尖油枯对青稞幼苗日增加长度的影响

从图5可以看出,青稞幼苗对青刺尖油枯气态挥发物较敏感.同一质量浓度,随着处理时间的增加,各个质量浓度的青刺尖油枯都对青稞幼苗的生长抑制作用逐渐增强,导致幼苗的生长缓慢.随着青刺尖油枯气态挥发物质量浓度的增加,处理相同时间的抑制曲线在0～0.18 g/cm3呈下降趋势,但是,在0.18～0.72 g/cm3稍有升高,却仍然低于初始的数值,在0.72～2.88 g/cm3高于初始的数值.与空白组比较,0.18～0.72 g/cm3的各个处理组,豌豆幼苗平均长度均达到极显著水平(P<0.01);而在0.18～0.72 g/cm3,1～10 d的处理没有显著差异,但是,11～16 d的处理有显著差异性(P≤0.05).因此,青刺尖油枯质量浓度0.18 g/cm3时,对豌豆幼苗的抑制作用最强.

从图6可以看出,与空白组比较,各个青刺尖油枯的高低质量浓度处理组,都对豌豆幼苗的日增加长度有显著的抑制作用(P≤0.05).在0.18～1.44 g/cm3,与空白对照比较,各处理组的豌豆幼苗的日增加长度差异均达到极显著(P<0.01),质量浓度为2.88 g/cm3时,各处理组的豌豆幼苗日增加长度差异不显著.因此,青刺尖油枯的质量浓度在1.44 g/cm3对豌豆幼苗日增加长度的抑制作用最强,质量浓度增大到2.88 g/cm3时没有显著差异,呈现抑制的饱和现象.

2.7 青刺尖油枯气态挥发物的不同处理时间对豌豆胚芽伸长的影响以处理时间为横坐标,分别以豌豆胚芽的长度、日增加长度为纵坐标,得到不同质量浓度青刺尖油枯处理对豌豆种子萌发的影响,结果见图7和图8.

部分班组长擅自将其他验收合格脚手架牌子拆卸，挂于未经验收合格的脚手架，企图蒙混过关。项目部制定制度，对于该行为予以严格处罚，同时，安排脚手架主管对所有脚手架挂牌情况建立台账，只有脚手架主管及脚手架检查工程师拥有挂牌和移牌权利，挂牌不能使用铁丝，必须使用脚手架主管的专用工具。最终彻底杜绝了该行为发生，避免企业形象受损。

图7 青刺尖油枯气态挥发物对豌豆胚芽长的影响

从图7可以看出,青刺尖油枯气态挥发物浓度在由低到高的变化过程中,豌豆胚芽的伸长随着处理时间的增加,均值呈现上升的趋势.处理1～9 d的曲线较陡,即豌豆胚芽长增长较快;处理9～16 d的曲线平缓,即豌豆芽长增长较缓慢.分析比较同一处理时间曲线的变化,可以看出处理的浓度越低,曲线越低矮,呈现出对豌豆胚芽伸长的抑制现象.

从图8可以看出,对照组第2天的日增加量为(1.33±0.54) cm,第7天的日增加量达到高峰,为(2.07±0.45) cm,第8天的日增加量明显下降,为(0.64±0.59) cm.0.18 mg/m3极低浓度组的日增加量最低,与其他组比较,差异显著(P≤0.05),第2天的日增加量为(0.91±0.0.36) cm,第7天的日增加量达到高峰,为(2.32±0.91) cm,第8天的日增加量明显下降,为(0.53±0.39) cm.因此,青刺尖油枯在0.18 mg/m3极低质量浓度时,对豌豆种子的胚芽伸长的日增加量抑制作用最强.

2.8 青刺尖油枯气态挥发物的处理质量浓度和处理时间对青稞胚芽伸长的影响回归分析表明,青刺尖油枯的不同质量浓度处理和不同处理时间,对青稞种子的胚芽伸长有相关性.可建立“质量浓度、处理时间-胚芽伸长”方程,计算出方程的决定系数r2=0.162.

l青稞=3.804+0.898x+0.527y,

其中,l青稞表示青稞胚芽长(cm),x为提取物处理质量浓度(mg/cm3),y表示处理时间(d).从方程可知,青稞种子的胚芽伸长量与青刺尖油枯的质量浓度呈极显著的正相关,即处理质量浓度越大,青稞胚芽的芽长越短.青稞种子的胚芽伸长量与处理时间的相关性不显著.

青刺尖油枯不同质量浓度处理、不同处理时间,对青稞种子的胚芽伸长日增加量有相关性.建立方程,得到方程的决定系数r2=0.162,此决定系数较低,因此,青稞种子的胚芽伸长日增加量与青刺尖油枯质量浓度、处理时间的线性不显著.

2.9 青刺尖油枯气态挥发物对豌豆、青稞幼苗的IC50由于各质量浓度青刺尖油枯对豌豆、青稞幼苗的抑制率不呈线性关系,所以可用SPSS的Probit法分别进行回归分析[15],得方程:

PROBIT(P)=Intercept+BX,

模型的拟合优度可以用卡方检验,再从Probit分析的结果中,可查得IC50值(即P=0.50时,样品的质量浓度)及其95%置信区间值,结果见表3.

表 3 青刺尖油枯挥发物对豌豆和青稞幼苗的IC50值

试验结果表明,青刺尖油枯对豌豆、青稞幼苗,IC50值分别为0.752和4.160 μg/mL.IC50值越小,表明抑制作用越强.从试验结果可知:青刺尖油枯对豌豆幼苗的生长抑制作用强于对青稞幼苗的生长抑制作用.

2.10 青刺尖油枯气态挥发物的GC-MS分析结果实验扣除本底的杂质,从青刺尖油枯中测定出40种挥发性物质,主要有萜类、醇类、酯类、烷烃类和氮类等5大类物质,其中,以萜类物质含量最高,也是挥发性物质的主要成分,总离子流如图9所示,挥发性物质的成分名称、保留时间和相对质量分数结果如表4所示.

图9 青刺尖油枯挥发性物质的总离子流

青刺尖种子富含萜类化合物,刘云环[21]从青刺尖茎叶和种子中分离鉴定出多种萜类物质,文献[8]从青刺尖茎叶分离鉴定出2个三萜类,文献[9]从青刺尖分离鉴定出9个三萜类,Takaishi等[22]从青刺尖分离鉴定出2个半萜类,Rai等[11]确定了13种单萜.现有研究表明,酚类和萜类是高等植物较为常见的化感物质,萜类化合物在植物生命活动中有重要作用,在天然产物中占比很大,而且单萜类和倍半萜类具挥发性,是植物化感作用的关键物质.因此,青刺尖油枯具有化感作用.

本试验检测到的邻苯二甲酸二乙酯等具有化感作用.Keire等[23]报道邻苯二甲酸二乙酯具有化感作用.Bais等[24]研究表明,相对含量大的物质并不一定有化感作用.由此可以推断,检测出的邻苯二甲酸二乙酯和姜黄烯等物质可能是青刺尖油枯的化感作用的主要成分,但同时,也不排除检测出的其他物质具有化感作用.植物的化感作用常常是几个或几类化合物综合作用的结果,化感物质之间常常有协同或拮抗作用,鉴定各单体化合物的化感活性及其相互之间的作用还有待于进一步研究.

表 4 青刺尖油枯挥发性物质的主要化学成分及其相对质量分数

3 结论

植物化感作用是近年来的研究热点,萜类是存在于自然界的一类具有(C5H8)n结构,且具有挥发性的碳氢化合物及其含氧饱和度不同的衍生物总称,主要通过甲瓦龙酸和异戊烯焦磷酸途径进行生物合成,是第二大类的化感物质[25].Fischer等[26]总结了萜类化感作用的特点,在自然条件下,对植物的发芽和生长的抑制呈季节性变化,一般在夏季萜类物质的抑制性较强.萜类混合物对发芽具有高抑制作用,但是,其纯物质在低质量浓度时具有促进作用,即呈现“低促高抑”的现象.化感作用抑制植物幼苗的正常生长,从而导致植株矮小、瘦弱,影响对光的竞争.因此,作为肥料的青刺尖油枯对豌豆、青稞等经济作物,其化感作用可能导致产量降低.朱宇林等[27]认为化感物质的处理可影响种子发芽ATP的产生和呼吸作用.大量研究证实黄花蒿对周围植物有很强的化感作用,对禾本科植物种子的萌发和生长均有抑制作用[28].

本试验研究采用比较常用的生长和发育测定法[29],在透明密闭的干燥室内用不同质量浓度的青刺尖油枯,对豌豆、青稞幼苗分别进行处理,评价油枯的化感作用,探讨其化感作用.结果表明:一定质量浓度的青刺尖油枯,挥发出的气态物可显著抑制豌豆种子和幼苗,其生长量和日增加量随青刺尖油枯质量浓度的升高,抑制作用呈现先高后低的现象.青刺尖油枯在质量浓度0.18～2.88 g/cm3,对青稞和豌豆的幼苗生长有不同影响,对豆科的豌豆,在此质量浓度范围均表现出抑制效果,而且呈现饱和效应;对禾本科的青稞,低质量浓度表现为抑制,高质量浓度表现为促进作用.GC-MS分析测定结果表明,青刺尖油枯的挥发性成分中萜类物质含量最高,是挥发性物质的主要成分,应该是化感作用的活性物.因为属于不同科的植物,豌豆和青稞可能对青刺尖油枯中挥发性的化感反应机制有差异性,从而表现出明显的区别,具体机制有待进一步研究.

致谢 四川师范大学项目(14yb29)对本文给予了资助,谨致谢意!