溃疡性结肠炎患者临床特征及肠道菌群变化分析

周淑萍 盛晓曼 蒋灿灿

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)属于多因素起源的慢性肠道炎症,病变可浸润至黏膜层和黏膜下层,可由远向近侵及整个结肠[1,2]。UC在发达国家的发病率居高不下,在发展中国家也不断攀升,UC发病率较克罗恩病高出很多[3,4]。UC病程从无症状、轻度到广泛结肠病变不等,有20%～30%的UC患者可出现侵袭性病程,其中10年内累积复发风险为70%～80%,近半数的患者需住院治疗[5]。因此,早期分层和早期识别有疾病进展和(或)重症风险的患者是溃疡性结肠炎治疗的关键。尽管UC的发病机制目前尚不明确,当前被广泛接受的病因学框架涉及遗传易感性、微生物与环境生态失调和免疫反应异常等,人们普遍认为肠道微生物生态失衡与UC的发病机制存在密切联系,而肠道微生物群被认为是反映UC自然史的“指纹”,因为其与UC临床严重程度、缓解和突发反应等有关[6,7]。来自UC患者的肠道菌群通常以兼性厌氧菌的相对丰度增加,以及专性厌氧菌的消耗为特征[8]。短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)是厌氧菌对复杂且难消耗糖链进行生化分解的最终产物,若产生SCFA的保护性细菌数量减少,可使黏膜通透性增加,相反,某些细菌浓度升高会增加有毒代谢物的产生,例如,H2S会增加黏膜通透性并阻断丁酸盐代谢[9]。丁酸盐是SCFA的一种,除了改善上皮和黏膜屏障功能以外,还可为结肠细胞的生长增殖提供能量[10]。微生态学缺陷以及相关的代谢途径和分子机制在UC肠黏膜的先天免疫中起着关键作用,鉴于世界范围内UC患病率的不断增加,以及失调性肠道微生物与UC关系的研究热度较高,本文聚焦于UC发病的宿主易感因素,观察UC患者肠道菌群的特征性变化,以期为UC临床靶点的寻找提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年4月至2021年12月就诊淮南市第一人民医院消化内科的UC患者50例为UC组,男24例,女26例;平均年龄(49.84±14.19)岁;经结肠镜检查及病理组织学确认,均符合2018年《中国炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》的诊断标准[11]。对照组为同时期就诊的30例健康者,男14例,女16例;平均年龄(48.90±11.27)岁;经检查均无消化道疾病。取样前4周所有纳入人员均未给予抗生素等药物干预。

1.2 样本采集 留取上述纳入人员新鲜粪便6 g,冻存于-80℃冷冻库中。同时收集纳入人员的基本情况(包括病程、年龄、性别、既往史等)及临床特征等。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取:按说明书操作提取样品的DNA,通过紫外微量分光光度计及凝胶电泳检测对DNA浓度进行定量,随后评价DNA完整性(Agilent 2100),质控合格的DNA纳入文库构建。

1.3.2 文库构建:以不同样本DNA为模板,选择16S rRNA基因V3-V4可变区进行扩增,并加上测序仪所需的接头、测序引物和index序列,构建文库。

1.3.3 16S rRNA测序:使用高通量测序平台进行测序。

1.3.4 生物信息学分析:对测序结果予以质控及过滤得到新的优化后序列,继而采用CD-HIT软件进行聚类分析,并对这些优化序列进行可操作分类单位(operational taxonomic units,OTUs)分析。并通过宏基因组分析手段对不同样本间的菌群进行差异性分析。

2 结果

2.1 UC患者临床主要特征表现 50例UC患者慢性复发型40例(80%),发病时处于活动期42例(84%),且重度较多(19例),多累及全部结肠(25例)。见表1。

表1 入组患者的疾病特征

2.2 病变范围与疾病严重程度的关系 不同病灶位置与疾病的严重程度存在相关性(P<0.05),即UC波及范围越广,其病情越重。见表2。

表2 病灶范围与疾病严重程度的关系 例

2.3 肠道菌群构成 使用16S rRNA测序技术对UC组和对照组的肠道微生物群的构成进行了分析,2组样本共检出11个门。2组样本均以拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门为优势菌门,但菌群的比例结构存在明显差异,相较于正常对照组,UC患者肠道菌群构成的多样性显著减少,且UC组变形菌门的相对丰度明显更高(P<0.01)。见表3,图1。

图1 门水平上2组丰度比较

表3 UC患者组和健康对照组肠道菌群门水平物种相对丰度比较 %,中位数(范围)

2.4 重度UC的肠道菌群变化 研究对比UC组和对照组中肠道微生物群的分布情况发现,在属水平上,与Hespellia菌属、Faecalibacterium(普拉梭菌)、Enterococcus(肠球菌)、Atopobium(奇异菌属)、Streptophyta(链形植物)相比,UC组大肠杆菌的比例升高最明显(P=0.028)。见表4。

表4 UC患者组和健康对照组肠道菌群的特征菌属比较 %,中位数(范围)

3 讨论

UC作为一种炎症性肠道疾病,其临床表现多为复发与缓解交替出现,且以易反复、诊疗困难等为特点。长期以来,UC的发病率持续走高,对全球数百万人的正常生活造成困扰。临床资料分析显示,有4/5的UC患者处于慢性复发型,且绝大多数是活动期(占比84%),同时,本研究还发现,病变范围未超过左半结肠的多为轻度UC,而超出左半结肠的以重度为主,即病变范围与疾病的严重度密切相关。

目前的研究报告了UC患者肠道微生物群平衡的变化,这是微生物菌群在UC发病机制中可能起作用的基础。尽管尚不清楚生态失调是肠道炎症的病因还是结局,但许多研究表明,肠道微生物群是宿主免疫系统、肠道相关淋巴组织的关键元素[12]。在健康条件下,寄居于肠道的微生物数量约是人体细胞数的10倍[13]。肠道微生物群主要定植于胃肠道,特别是在结肠中,后者可为其提供生长所需的氧和营养[14]。尽管肠道微生物群的组成存在相当大的个体差异,但在较高的分类水平下,不同个体间微生物群是相似的。放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、变形杆菌门是肠道微生物的四个主要门,其中拟杆菌门和厚壁菌门占比九成以上[15]。

众所周知,肠道菌群不但可以维持胃肠道正常生理功能,还是阻止其他胃肠道病原体入侵的屏障。肠道微生物的稳态是维护肠道正常功能的关键,而微生物群的生态失调可能是某些疾病的促成因素。肠道黏膜的完整性取决于它与肠道微生物群间的相互平衡,若两者间出现不平衡状态,势必会影响肠道防御功能及免疫调节功能。在本研究中,我们发现相较于对照组,UC组中微生物群的多样性明显减少,且以厚壁菌门表达显著降低为主,这与其他研究者的结论相同[16-18]。此外,在许多肠道微生物组研究以及我们的分析中,已经观察到健康受试者以及UC患者中肠道菌群显示出巨大的个体差异,进一步验证表明,UC患者肠道中变形菌门所占比例明显增加,且以大肠杆菌的增加为主,这与健康参与者的构成比例显著不同,该结果与Forbes等[19]的结论相似。有研究表明,大肠杆菌与炎症相关,因其可产生大量过氧化氢,这反过来又导致厌氧菌数量的减少,并且可以刺激免疫细胞释放促炎因子[20]。UC患者和对照组之间的物种差异性在我们的研究中也通过分析得到证实,该分析表明2组样本中不同微生物门、属间存在很大的差异性。UC和健康队列之间的差异性可能是由于疾病引起的肠道微生物群环境的变化而引起的。

研究发现UC患者与健康者的肠道菌群存在着明确的菌群结构失调以及菌群结构改变,但作为初步探索性研究,仍存在一定的缺陷性。首先,尽管16S rRNA分析提供了肠道中存在的微生物分类组成,但其未对微生物群在UC中发挥的作用作出分析。其次,未明确区分不同时期UC患者肠道微生物群落的差异,难以为后期治疗提供依据。最后,可能需要更大的样本量来证实我们的数据,且需进一步的研究来更好地表征肠道微生物群的代谢产物在UC患者中的作用。

本研究对UC的疾病特征进行了总结,并阐明肠道微生物群在UC发病机制中起到关键作用。健康的微生物群具有与宿主保持体内平衡状态的能力,而肠道菌群稳态的恢复可有助于UC患者的转归。