circ_0003221/miR-330-3p在骨肉瘤组织中的表达及对U2-OS增殖迁移的影响

闫晓红 方美花 王伟 张军

骨肉瘤也称为骨癌,在青少年中发病率最高,复发或转移患者生存率低,靶向治疗骨肉瘤药物的研发及临床应用已经取得一定疗效,仍需从基因层面寻找精准的靶向治疗药物[1,2]。研究表明miRNA在骨肉瘤的诊断、治疗和预后中起着重要作用[3]。有研究报道,miR-330-3p在骨肉瘤组织和细胞系中的表达降低,miR-330-3p过表达显著抑制MG-63和U2OS骨肉瘤细胞的生长[4]。circ_0032463通过调节miR-330-3p/PNN轴促进骨肉瘤的进展[5]。生物学软件预测发现circ_0003221与miR-330-3p有结合位点。有研究报道circ_0003221(circPTK2)促进膀胱癌细胞的增殖和迁移[6]。circPTK2在胃癌组织和细胞中上调表达,下调circPTK2抑制胃癌肿瘤的生长和转移[7]。然而笔者发现circ_0003221对骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响尚不清楚。本试验旨在研究circ_0003221是否通过调控miR-330-3p影响骨肉瘤细胞增殖和迁移,报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2021年1月我院收治的37例骨肉瘤患者,通过手术取其瘤组织、瘤旁组织,患者均知情且同意。

1.2 细胞与主要试剂 U2-OS细胞(美国ATCC);RPMI-1640培养基、MTT试剂盒(美国Sigma公司);Trizol试剂、荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物);Transwell小室(美国康宁公司);双荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国AAT Bioquest)。

1.3 细胞处理与分组 U2-OS细胞常规培养于RPMI-1640培养基中,取对数生长期细胞,将si-NC、si-circ_0003221、miR-NC、miR-330-3p mimic分别转染至U2-OS细胞,记为si-NC组、si-circ_0003221组、miR-NC组、miR-330-3p mimic组;将si-circ_0003221分别与anti-miR-NC、miR-330-3p Inhibitor共转染至U2-OS细胞,记为si-circ_0003221+anti-miR-NC组、si-circ_0003221+miR-330-3p Inhibitor组。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测circ_0003221和miR-330-3p的表达水平 转染结束后提取组织及各组细胞的总RNA,合成cDNA后进行PCR检测,相对表达量用2-ΔΔCt法计算。以β-actin和U6为内参。

1.5 双荧光素酶报告实验 将circ_0003221野生型和突变型荧光素酶载体分别与miR-NC和miR-330-3p共转染至U2-OS细胞,并且按说明书检测荧光素酶活性。

1.6 MTT检测细胞增殖抑制率 各组细胞培养48 h,加入20 μl MTT溶液培养4 h,加入150 μl二甲基亚砜,反应15 min,酶标仪检测490 nm处吸光度值(OD),计算增殖抑制率。

1.7 克隆形成实验检测集落形成数 各组细胞接种于6孔板,培养2周,经甲醇固定和结晶紫染色,低倍光学显微镜下计数>50个细胞的集落。

1.8 Transwell检测细胞迁移数 将100 μl无血清培养基悬浮的细胞添加到Transwell上室,培养48 h,用棉签除去膜顶表面上未迁移的细胞;甲醇固定30 min,结晶紫染色30 min,用PBS轻轻清洗2次,倒置显微镜拍摄并计数细胞。

1.9 划痕实验检测细胞划痕愈合率 将各组细胞接种在培养板中培养,细胞铺满板底后用枪头直线划痕,用PBS冲洗划下的细胞,换液后继续培养,在培养0 h和48 h后拍照观察,用Image-Pro Plus6.0软件计算划痕愈合率。

2 结果

2.1 circ_0003221和miR-330-3p在骨肉瘤组织中的表达 骨肉瘤组织中circ_0003221表达水平高于瘤旁组织,而miR-330-3p表达水平低于瘤旁组织(P<0.05)。见表1,图1。

表1 circ_0003221和miR-330-3p在骨肉瘤组织中的表达 n=37,

2.2 circ_0003221和miR-330-3p相关性分析 Pearson分析结果显示,circ_0003221和miR-330-3p的表达水平呈负相关(r=-0.9271,P<0.05)。见图2。

图2 circ_0003221和miR-330-3p呈负相关

2.3 circ_0003221和miR-330-3p对U2-OS增殖的影响 与si-NC组相比,si-circ_0003221组circ_0003221表达水平降低(P<0.05),U2-OS细胞增殖抑制率升高,克隆形成数减少(P<0.05);与miR-NC组相比,miR-330-3p mimic组U2-OS细胞增殖抑制率升高,克隆形成数减少(P<0.05);与si-circ_0003221+anti-miR-NC组相比,si-circ_0003221+miR-330-3p Inhibitor组U2-OS细胞增殖抑制率降低,克隆形成数增加(P<0.05)。见表2。

表2 circ_0003221和miR-330-3p对U2-OS增殖

2.4 circ_0003221靶向调控miR-330-3p Circular RNA Interactome预测显示circ_0003221和miR-330-3p有结合位点;miR-330-3p与wt-circ_0003221共转染后细胞荧光素酶活性降低(P<0.05);与si-NC组相比,si-circ_0003221组miR-330-3p表达水平升高(P<0.05)。见表3、4,图3。

图3 circ_0003221靶向调控miR-330-3p和miR-330-3p互补序列

表3 双荧光素酶报告实验结果 n=9,

表4 circ_0003221调控miR-330-3p的表达 n=9,

2.5 circ_0003221和miR-330-3p对U2-OS迁移的影响 与si-NC组相比,si-circ_0003221组U2-OS细胞迁移数减少,划痕愈合率降低(P<0.05);与miR-NC组相比,miR-330-3p mimic组U2-OS细胞迁移数减少,划痕愈合率降低(P<0.05);与si-circ_0003221+anti-miR-NC组相比,si-circ_0003221+miR-330-3p Inhibitor组U2-OS细胞迁移数增加,划痕愈合率升高(P<0.05)。见表5。

表5 circ_0003221和miR-330-3p对U2-OS迁移能力

3 讨论

作为儿童和青少年中普遍存在的骨肿瘤,骨肉瘤的发病和转移机制仍未完全明确。尽管骨肉瘤治疗方法(如辅助化疗和手术切除)取得了进展,但患者生存率仍不令人满意；且尚缺乏骨肉瘤的特异性诊断和预后生物标志物。分子靶向治疗是骨肉瘤的治疗方式之一,其具有更强的精准性及特异性,已成为获得更佳治疗效果的新希望[8,9]。因此,本实验通过研究骨肉瘤的分子机制以寻找可靠的分子靶点。

已发现circRNA表达异常与各种癌症的发病机制相关,并对基因表达、细胞侵袭、细胞周期进程、迁移、凋亡和增殖产生重要的调节作用。此外,鉴于其结构稳定性、进化保守性、丰度和器官特异性,circRNA被认为具有很高的诊断和治疗潜力。circ_0003221(也称为circPTK2,chr8:141856358-141900868)是近年来新发现的一种circRNA,据报道circ_0003221在宫颈癌组织和细胞中上调;敲除circ_0003221可抑制宫颈癌细胞的细胞增殖、迁移、侵袭[10]。circPTK2通过调控miR-92a抑制肝癌细胞增殖和迁移[11]。敲低circPTK2可抑制胃癌细胞增殖,并促进凋亡[12]。以上研究表明circ_0003221(circPTK2)可参与多种肿瘤的发生发展过程,有望作为肿瘤的可靠分子靶点。但笔者未找到关于circ_0003221对骨肉瘤影响的相关研究结论。

本实验检测了骨肉瘤组织中circ_0003221的表达,结果显示,骨肉瘤组织中circ_0003221表达水平升高,提示circ_0003221可能在骨肉瘤中起促癌作用。进一步干扰circ_0003221后,U2-OS细胞增殖抑制率升高,克隆形成数和迁移细胞数减少,划痕愈合率降低;表明干扰circ_0003221可抑制骨肉瘤U2-OS细胞增殖和迁移。提示,circ_0003221或可成为骨肉瘤的分子治疗靶点。

circRNA可以通过与miRNA反应元件竞争性结合,作为竞争性内源性RNA(ceRNA),也称为miRNA海绵,调节下游靶基因的表达。基于这种调控,circRNA可以作为miRNA海绵来调控靶基因的表达,形成调控circRNA-miRNA-mRNA网络。miR-330-3p在多种癌症中充当抑癌基因,研究报道miR-330-3p通过下调CELF1的表达抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移[13]。miR-330-3p通过靶向RIPK4抑制卵巢癌的进展[14]。在三阴性乳腺癌中,Circ-PGAP3可通过下调miR-330-3p表达促进三阴性乳腺癌的恶性进展[15]。此外,已有研究证实miR-330-3p过表达能抑制骨肉瘤细胞的生长[4]。

本实验结果显示,骨肉瘤组织中miR-330-3p表达水平降低,过表达miR-330-3p可抑制骨肉瘤U2-OS增殖和迁移;与前人研究结果相符,表明miR-330-3p在骨肉瘤中起抑癌作用。且本试验发现circ_0003221与miR-330-3p的表达呈负相关;生物信息学预测显示,circ_0003221与miR-330-3p存在互补的结合位点;双荧光素酶证实,circ_0003221与miR-330-3p存在相互作用,且RT-qPCR结果显示敲低circ_0003221可上调miR-330-3p表达,表明circ_0003221可靶向负调控miR-330-3p;推测miR-330-3p可能是circ_0003221参与骨肉瘤进展的下游靶基因。为了验证此推测,本研究在干扰circ_0003221的基础上采用miR-330-3p inhibitor转染来下调miR-330-3p表达,结果发现抑制miR-330-3p表达可逆转干扰circ_0003221对U2-OS细胞增殖和迁移的影响。提示干扰circ_0003221可能通过靶向上调miR-330-3p表达抑制骨肉瘤U2-OS细胞增殖和迁移。

综上所述,circ_0003221在骨肉瘤组织中高表达,干扰circ_0003221可通过上调miR-330-3p抑制骨肉瘤细胞U2-OS增殖、迁移;circ_0003221、miR-330-3p均可能作为骨肉瘤分子治疗的靶点。