中药调控Beclin-1基因干预自噬治疗类风湿性关节炎的研究进展

张筠昊 白皓天 梁霄 文武龙 张炜烨 李娅兰 孙鑫 肖展 杨婧 王锐

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性关节疾病,主要特征是持续性滑膜炎、全身性炎症和自身抗体的生成,同时会导致软骨损伤、关节残疾以及心血管和肺部等疾病。其发病原因复杂[1-3],但与线粒体密切相关,线粒体功能障碍会诱导关节炎症,导致RA的产生。现阶段治疗RA方法包括药物治疗、手术治疗和基因治疗等,目前非甾体抗炎药是治疗RA的一线药物,虽然可以在短时间内缓解疼痛,但疗效短暂无法无法抑制RA的病程发展,同时存在着胃肠道反应等不良反应,因此,中药以其治疗RA毒副作用较小,干预基因和线粒体等多靶点多途径等优点,在RA治疗领域扮演者越来越重要的角色。自噬 (autophagosome)指细胞将本身待降解物通过双层膜包裹形成自噬体,运输到溶酶体形成自噬溶酶体降解包容物,并完成细胞的本身代谢和衰老死亡细胞器的更新的过程[4]。根据底物的不同分为微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperonemediated autophagy,CMA)。自噬参与到蛋白质的代谢、清除破损线粒体和细胞重建的过程中,并通过更新受损的线粒体维持细胞、组织和机体的稳态平衡,且该过程广泛地存在于细胞的病理生理过程中。随着自噬研究的不断深入,自噬在RA中作用引起国内外学者的广泛关注,其在RA疾病发展中扮演着越来越重要的角色,因此拨开RA与自噬之间的层层迷雾,可为RA的治疗提供一定的启发。Beclin-1是自噬的重要标志物,作为自噬的起始因子并参与到细胞中的自噬和凋亡,也是合成自噬体的必需基因,并引导自噬蛋白定位自噬泡进而达到调控自噬体的生成[5,6],同时可通过调控Beclin-1激发自噬活性抑制RA、神经退行性疾病和肿瘤等疾病。Beclin-1在上述疾病中扮演重要的角色,深入研究中药调节Beclin-1管控细胞自噬治疗RA的作用机制具有重要意义。本文对中药调控Beclin-1通过自噬治疗RA的机制的研究进展进行综述性总结。

1 自噬与线粒体

自噬是细胞维持稳态的保护机制,通过更新清除功能失调的细胞器来运转维持整个机体[7]。而线粒体是细胞内重要的枢纽,对维持细胞及细胞器的平衡有着重要的作用,细胞器调控包括自噬在内的多种生理活动。自噬的激活降低线粒体障碍的风险,同时抑制自噬会导致明显的线粒体功能障碍,自噬防止软骨细胞中线粒体功能的失调,而线粒体功能的障碍也会导致体内自噬反应的降低[8]。同时高活性氧(ROS)条件下,线粒体会出现功能障碍,体内自噬的激活降低,从而导致线粒体的功能和屏障完整性消失[9,10],并且ROS升高导致膝关节软骨细胞的合成降低,炎性反应的增加导致线粒体功能障碍,而线粒体的功能障碍会诱发RA等退行性疾病。

2 自噬与RA

自噬与RA在内的多种风湿疾病密切相关[11],自噬促进自我耐受,但异常的自我耐受会导致RA等风湿免疫疾病,全基因组关联研究(GWAS)将自噬与风湿免疫性疾病相关联,证明自噬在RA的发病机制中发挥功能性作用。自噬与类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASFs)相关,自噬的抑制促进RASFs的凋亡,即表明其参与RASFs细胞凋亡过程[12]。自噬和凋亡之间平衡机制的改变被认为是RA的致病原因,由自噬过程介导的凋亡导致了进行性的骨和软骨的破坏[13],研究表明,破骨细胞的形成和自噬途径之间存在着联系,在实验性关节炎小鼠模型中,经过自噬抑制剂的治疗,骨侵蚀明显减少[14]。自噬不但在破骨细胞生成中发挥作用,而且也导致促炎因子的分泌、产生、增殖。自噬对细胞有双重作用,正常条件下,自噬对细胞具有保护作用,诱导条件下,则会导致细胞的死亡。自噬相关的炎症和组织增生会导致关节的破坏,而破骨细胞内自噬蛋白增加会进一步导致骨吸收发生,并促进骨和软骨的关节破坏[15]。抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPAs)可以导致滑膜炎和软骨破坏,自噬促进瓜氨酸多肽表达和ACPAs的产生,而增加的自噬导致RA成纤维细胞样滑膜细胞产生瓜氨酸蛋白,同时成纤维样滑膜细胞(FLS)与ACPAs呈现出正相关[16],表明自噬参与到瓜氨酸酸化过程当中。

3 自噬与Beclin-1基因

Beclin-1在自噬体形成起到关键性作用,是自噬与凋亡途径的重要汇聚点[17,18]。Beclin-1可以通过与抗凋亡家族基因Bcl-2结合来抑制自噬体的形成,在没有刺激的条件下,Beclin-1与Bcl-2等形成复合物,但在内外部刺激下,Beclin-1在复合物中被释放从而激活自噬体的形成。此外,多种自噬基因表达受Beclin-1的统筹调控,Beclin-1调节自噬的正相关因子Protein-1和AMBRA1,而miR-30a与Beclin-1的含量呈负相关,Beclin-1调节miR-30a表达来介导自噬[19],Beclin-1激活会增强TNF-α的表达。Beclin-1在RASFs自噬诱导的复杂网络中代表着决定性节点,并在自噬调节中起到不可或缺的作用。研究表明,在RA发展过程中,Beclin-1在成纤维细胞中表达降低,并通过Beclin-1表达水平的波动监测RA滑膜细胞变化[20]。越来越多的研究发现,Beclin-1、自噬和线粒体的相关性,在RA的发病机制中发挥重要作用。见图1。

图1 Becling-1基因调控细胞自噬及线粒体自噬的过程

4 单味中药干预Beclin-1调节自噬抗类风湿性关节炎

单味中药与成分复杂的复方相比,药效较为明确,而从单味中药中提取的中药单体是现代医学和传统中医药相结合的产物,其结构简单、成分单一便于进行质量安全性评价。当前发现的通过调控Beclin-1治疗RA的单体有白藜芦醇、大黄素、乌头碱和雷公藤甲素等。

4.1 虎杖 虎杖根部富含白藜芦醇(Resveratrol,Res),Res具有抗炎镇痛、抗氧化、改善微循环等药理作用。Res的作用机制是通过靶向下调Beclin-1的表达水平以降低FLS的自噬水平,自噬水平的降低导致活性氧类的积累、线粒体功能障碍,并诱导FLS凋亡和线粒体形态的改变,进一步促进FLS中线粒体膜电位的崩解丢失和ATPL能力的改变,Zhang等[21]实验论证Res改变线粒体膜电位从而靶向逆转降低自噬蛋白Beclin-1在FLS中的表达,抑制大鼠的氧化应激,增加mtROS的产生,从而促进FLS的凋亡,Res干预细胞的信号通路调节线粒体通透性,损伤线粒体膜电位[22,23],破坏电子呼吸链[24],增加线粒体超氧阴离子的产生。Res通过细胞途径诱导FLS凋亡,致使线粒体膜中的结构和自噬基因发生改变。同时细胞内ATPL的产生与Res浓度呈负相关[25]。Res增强大鼠体内的自噬通量来调节滑膜增生,在此过程减少NF-κB通路控制滑膜炎症[26],口服Res增强自噬通量并调节炎症的串扰存在而对RA具有保护作用。此外,关节内注射Res诱导自噬来延缓软骨退化[27-30],明显阻止线粒体功能障碍引起的血管生成反应从而调节血管生成来抑制滑膜的异常增殖。

4.2 大黄素 大黄素具有抗炎、镇痛、抗菌、抗癌抗肿瘤等多种药理作用。中性粒细胞(neutrophilie granulocyte,NE)在治疗RA中发挥积极作用[31],NE浸润炎症组织后,分泌大量的炎性因子,加重滑膜组织的炎性反应[32],并且在迁移到RA关节后会延迟自发凋亡,同时诱导宿主组织损伤的能力得到增强。Zhu等[33]研究证明大黄素显著降低白细胞和NE的聚集,抑制体外NE的迁移和激活,显著性下调炎性因子水平、减少炎症细胞浸润,缓解骨侵袭,同时大黄素特异性下调Beclin-1水平显著抑制NE自噬,并调节NE体内过程以减低关节炎症反应,因此,大黄素靶向调控Beclin-1调节体内NE活性干预自噬治疗RA,使关节功能正常化。潘书涵等[34]在模型组给药后,大黄素下调大鼠体内自噬基因的表达,抑制细胞自噬和凋亡,减低炎性反应,降低软骨和骨的损伤,抑制新生血管形成。

4.3 乌头 乌头具有抗炎、镇痛、调节免疫、抗肿瘤等功效,在中医古籍中有乌头“主瘫痪顽疾”之记载。研究证明,乌头通过上调Beclin-1的表达水平,降低P62蛋白的表达进而诱导细胞自噬[35],乌头中的有效成分显著增加Beclin-1的表达,Beclin-1在保护性自噬的调节中激活ERK1/2、p38信号通路和p53基因[36],并以时间依赖性方式增强p53表达水平,激活的p53、ERK1/2和p38诱导自噬,且P53抑制与自噬相关的mTOR,在自噬相关靶基因的转录调控中起重要作用[37]。邵鑫等[38]以不同浓度的乌头碱对RA-FLS细胞处理后发现,乌头碱通过促进自噬体的产生,进而导致RA-FLS细胞的凋亡。因此,乌头靶向调控Bclin-1的表达干预自噬,从而实现干预疾病的的过程。

4.4 雷公藤 雷公藤是治疗RA的传统中药,雷公藤具有抗炎、免疫抑制等药理作用,雷公藤甲素(Triptolide,TPL)是雷公藤主要活性成分,王明霞等[39]分别给与RA-FLSs不同浓度的TPL处理后,观测Beclin-1自噬因子的表达水平和TPL干预自噬的机制,表明TPL呈浓度依赖性有效抑制RA-FLSs增殖活力,并显著下调RA-FLSs的Beclin-1蛋白水平减弱自噬作用,达到抑制RA-FLSs增殖及促进凋亡的目的。研究证明,Beclin-1是细胞自噬启动过程中的关键调节因子[40],Xie等[41]研究发现,TPL下调Beclin-1抑制MH7A细胞的自噬水平,并呈浓度依赖性,而自噬抑制MH7A细胞的活动并维持机体的氧化还原平衡,同时该实验机制研究显示TPL激活MH7A细胞的PI3K/AKT信号通路减少Beclin-1的表达来抑制自噬,可见,TPL靶向调节Beclin-1干预自噬机制发挥其对RA的治疗作用。

5 中药复方调控Beclin-1干预自噬抗类风湿性关节炎

中药复方是中医用药的传统方式,将两种或两种以上的中药按照不同比例配伍使用,并根据中医望闻问切、辨证论治的结果,对复方进行加减使用,多味中药复合使用,可以到达相辅相成,增效减毒的目的。目前,通过调控Beclin-1治疗RA的复方有当归拈痛汤、当归四逆汤和金乌健骨汤等。

5.1 当归拈痛汤 当归拈痛汤首见于清代医家张元素的《医学启源》,具有疏风止痛、利热清湿,组方正邪兼顾、内外同治、气血并调、上下分消的功效的功效,是治疗风湿热痹症的经典名方[42,43],现代临床主要用于RA、下肢关节痛等湿热相博病症,现代药理研究发现当归拈痛汤具有抗炎、镇痛、免疫调节等作用。陆麒瑾等[44]通过分组给药的方式对RA-FLS细胞进行干预,发现当归拈痛汤通过靶向下调Beclin-1的表达干预自噬,同时提高RA-FLS细胞的凋亡水平,自噬的调节有效抑制RA-FLS细胞的迁移和侵袭,同时自噬的降低会明显抑制成纤维细胞的增殖。在风湿热痹型佐剂型关节炎大鼠体外实验中,探究Beclin-1在RA中的作用发现,当归拈痛汤减轻RA急性期炎症,滑膜细胞增生和炎性细胞浸润得到有效改善,精确靶向下调Beclin-1的表达调节自噬水平来实现使关节炎病情的有效缓解[45]。

5.2 当归四逆汤 当归四逆汤源于古代医圣张仲景的《伤寒杂病论》,以当归、桂枝、芍药等入药,具有温经散寒,养血通脉之功效,主治血虚寒厥证[46,47]。其具有抗炎、镇痛、解除痉挛等药理作用,现代临床应用于RA、心脑血管疾病等。研究证明,TLR/Beclin-1信号通路可激活诱导组织释放炎性因子,同时提高成纤维细胞生长因子活性,介导T淋巴细胞进一步增殖,刺激人体免疫反应[48]。TLR蛋白介导多种活化因子传递进细胞内,诱导细胞因子的产生,而Beclin-1可特异性参与到机体的自噬中,范卫闯等[49]发现,当归四逆汤可下调RA关节组织TLR/Beclin-1信号通路中Beclin-1的表达,进而抑制负反馈蛋白的表达,从而干预炎症信号通路的传导,并抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子的表达,调节机体的自噬过程进而控制免疫应答达,使RA病情改善。

5.3 金乌健骨方 苗药金乌健骨方是治疗RA的有效经典验方,由金毛狗脊、乌梢蛇、千年健、黑骨藤、小花青风藤等药物组成,具有活血化瘀、祛风除湿、强健筋骨的功效[50,51]。Beclin-1在细胞自噬过程中发挥关键作用,RA-FLS高度的自噬活性可形成自噬体并引发内质网应激反应从而上调Beclin-1的表达[52];马武开等[53]给与RA-FLS金乌健骨方提取物高、中、低浓度治疗24 h后,检测到苗药金乌健骨方抑制RA滑膜细胞自噬基因Beclin-1的表达,即证明金乌健骨方准确下调Beclin-1的表达,来抑制RA滑膜细胞的增生,达到通过自噬调控RA病情的作用。

5.4 程氏蠲痹汤 程氏蠲痹汤出自清代医家程国彭的《医学心悟》,具有祛风除湿、散寒活血、通络止痛的功效,临床用于治疗风湿疾病[54]。研究证明,程氏蠲痹汤对治疗RA具有明确的疗效,可以明显改善关节组织的炎症,抑制滑膜增生,调节机体免疫作用[55]。吴亚兰[56]研究发现,程氏蠲痹汤分组给药后,药物剂量与RA大鼠的治疗效果成正比,并通过提高滑膜细胞中Beclin-1的表达,增强滑膜细胞自噬水平,上调血清中IL-4的表达、抑制IL-17的表达,并调节细胞因子失衡,从而降低大鼠足趾肿胀度,缓解RA病情。

5.5 五味温通除痹胶囊 五味温通除弊胶囊,是由姜黄、桂枝、淫羊藿、茯苓等药物组成的方剂,具有健脾化湿,温阳通络之功效[57]。佐剂型类风湿性关节炎(AA)大鼠模型实验中,观察大鼠体内自噬小体和Beclin-1指标变化,发现滑膜组织和肺部自噬小体合成和Beclin-1蛋白水平下降,证实AA大鼠体内自噬水平不足[58]。在体实验中,大鼠给药28 d后,五味温通除痹胶囊对AA大鼠具有治疗作用,其机制促进细胞自噬,抑制滑膜细胞的过度增殖,减少AA所导致的滑膜组织的损伤,同时在体外实验中,滑膜组织中的Becclin-1基因表达水平增加,五味温通除弊胶囊显著促进Beclin-1的表达水平,减轻RA造成的膝关节和滑膜损伤[59]。见表1。

表1 中药及方剂调控Beclin-1干预自噬的机制

RA在中老年人中多发,具有较高的致残率,为家庭和社会带来沉重的经济负担。因此控制病程发展,减轻RA所致的关节残疾,是全世界都亟待解决的难题。本文系统性阐述中药及复方精准调控Beclin-1基因干预自噬,并为治疗RA提供新的研究方向。而对于中药调控Beclin-1干预自噬治疗RA的机制仍需更深层次的研究中,而对于中药介导的自噬通路和精确分子仍在进一步的补充验证中,同时这些中药仍有待在临床广发应用中,因此后续工作仍需验证中药调控Beclin-1干预自噬治疗RA的全面机制,并通过体内体外的实验明确中药治疗RA的机制,为中药及复方进一步应用于临床提供科学依据。