不同丙型肝炎病毒基因分型检测方法学的比较

马雯 何瑞芬 吴涛 闫俊霞 安超 朴文花

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染导致的疾病。丙型肝炎患病率为1%，我国约有1 000 万丙肝患者［1-2］。HCV 感染常导致肝脏的纤维化、硬化甚至肝细胞癌，严重影响患者的身体健康和生活质量［3］。近年来伴随着直接抗病毒药物的生产和使用，使得丙型肝炎的确诊率和治愈率不断提升，但在临床治疗过程中发现，感染者HCV 基因型、亚型与其临床症状的严重程度、抗病毒治疗的敏感性、疾病的转归等具有高度的相关性［4-5］，因此HCV 基因型的确定是丙型肝炎精准治疗的前提。本研究使用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）-荧光探针法、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）-反向点杂交法及Sanger 测序法对已确诊丙型肝炎的患者进行分型检测，比较三种方法的优缺点，综合分析各检测方法的性能，为实验室提供参考，同时为临床治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019 年1 月至2021 年12 月在宁夏回族自治区人民医院就诊的丙型肝炎确诊患者为研究对象，临床诊断均符合《丙型肝炎防治指南（2019 年版）》中的相关要求［3］。通过询问病史核对患者信息，排除重复就诊者后共收集病例148人，平均年龄（52.43±8.04）岁，男性78 例，女性70例。所有患者HCV 抗体为阳性（Anti-HCV≥5.0 S/CO），HCV-RNA 为阳性（HCV RNA≥1.0×103IU/mL），无合并其他感染（HAV，HBV，HEV，HCMV，EB）、肿瘤、免疫性疾病等，临床资料完整。本研究已通过医学伦理学委员会审查，所有患者均签署知情同意书。

1.1 样本

采集患者空腹静脉血3～5 mL，3 000 r/min 离心10 min，离心半径17.17 cm。吸取血清待用。

1.2 仪器与试剂

PCR-荧光探针法使用Applied Biosystems ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪，试剂由圣湘生物科技股份有限公司提供（注册证编号：20193400697），可检出5 种丙肝病毒亚型（1 型，2 型，3 型，6 型和1b型）。循环参数及荧光检测通道选择严格按照试剂盒说明书进行设定，内标基因Ct 值≤36 时即可对其他基因进行分析，结果判断依照试剂盒说明书进行。

PCR 反向点杂交法使用美国伯乐T100 PCR 仪，试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供（注册证编号：20153402110），可检出5 种丙肝病毒亚型（1b型，2a型，3a型，3b型和6a型）。RT-PCR 循环参数严格按照试剂盒说明书进行设定，杂交过程、显色、扫描及结果分析严格按照试剂盒说明书进行判读。

Sanger 测序法外送广州立菲达安诊断产品技术有限公司进行检测分析。核酸提取使用中山大学达安基因股份有限公司Smart32 全自动核酸提取仪及其配套试剂（粤穗械备20170667）。PCR 扩增使用中山大学达安基因股份有限公司丙肝基因分型检测试剂盒（PCR-测序法）（注册证编号：20183401798）及配套质控品、对照品。Sanger 测序使用Applied Biosystems 3730 基因分析仪，选择HCV 基因组核心/包膜1（core-envelop region 1，CORE/E1）区对样本进行测序分型。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。计数资料使用n（%）表示，使用χ2检验。检测方法一致性的比较使用加权Kappa检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR-荧光探针法检测丙肝基因分型

PCR-荧光探针法检出136 例，检出率91.89%，共检出4 种基因型，分别为1b、2+、3+和6+。见表1、图1。

图1 部分丙型肝炎患者PCR-荧光探针法基因分型检测结果Figure 1 Results of genotyping by PCR-fluorescent probe method in some patients with hepatitis C

表1 丙型肝炎患者PCR-荧光探针法基因分型检测结果［n（%）］Table 1 Results of genotyping of hepatitis C patients by PCR-fluorescent probe method［n（%）］

2.2 PCR-反向点杂交法检测丙肝基因分型

PCR-反向点杂交法检出135 例，检出率为91.22%，共检出5 种基因型，分别为1b、2a、3a、3b和6a。见表2、图2。

图2 部分丙型肝炎患者PCR-反向点杂交法基因分型检测结果Figure 2 Results of genotyping by PCR-reverse dot blot method in some patients with hepatitis C

表2 丙型肝炎患者PCR-反向点杂交法基因分型检测结果［n（%）］Table 2 Results of genotyping of hepatitis C patients by PCR-reverse dot blot method［n（%）］

2.3 Sanger 测序法检测丙肝基因分型

Sanger 测序法检出148 例，检出率100%，共检出7 种基因型，分别为1b、2a、3a、3b、6a、1g 和6xa。见表3、图3。

图3 部分丙型肝炎患者Sanger 测序法基因分型检测结果Figure 3 Results of genotyping by Sanger sequencing in some patients with hepatitis C

表3 丙型肝炎患者Sanger 测序法检测结果［n（%）］Table 3 Results of genotyping of hepatitis C patients by Sanger sequencing［n（%）］

2.4 PCR-荧光探针法与Sanger 测序法的比较

PCR-荧光探针法未检出的12 例样本中，Sanger 测序法均已检出，其中包括1 例6xa 型，1 例1g 型。两种方法的检出率比较差异无统计学意义（χ2=7.565，P＞0.05），见表4。两种方法比较一致性较高（κ=0.871，P＜0.001）。见表5。

表4 PCR-荧光探针法与Sanger 测序法检出率的比较［n（%）］Table 4 Comparison of the detection rate between PCR-fluorescence probe and Sanger sequencing［n（%）］

表5 PCR-荧光探针法与Sanger 测序法一致性分析Table 5 Consistency analysis between PCR-fluorescence probe method and Sanger sequencing

2.5 PCR-反向点杂交法与Sanger 测序法的比较

PCR-反向点杂交法未能测出的13 例样本，Sanger 测序法均已检出，其中包括1 例1g 型。PCR-反向点杂交法检出1 例3b 型，Sanger 测序法检出为6xa 型。两种方法的检出率比较差异无统计学意义（χ2=8.696，P＞0.05），见表6。PCR-反向点杂交法与Sanger 测序法一致性高（κ=0.609，P＜0.05）。见表7。

表6 PCR-反向点杂交法与Sanger 测序法的比较［n（%）］Table 6 Comparison of the detection rate between PCR-reverse dot blot method and Sanger sequencing［n（%）］

表7 PCR-反向点杂交法与Sanger 测序法一致性分析Table 7 Consistency analysis between PCR-reverse dot blot method and Sanger sequencing

3 讨论

丙型肝炎具有极强的隐匿性，发展为肝硬化、肝细胞癌的可能性极大［2，6］。为尽快实现消除病毒性肝炎的目标，要求提高HCV 患者的确诊率和治疗率，在治疗过程中针对使用基因型特异性药物治疗的HCV 感染者进行HCV 基因分型检测［7］。

由于HCV 基因组的变异性及检测方法的局限性，约10%的丙肝基因分型检测会出现漏检、误检以及混淆的现象［8］。目前可用于HCV 分型检测的方法包括测序法、型特异性引物扩增法、限制性片段长度多态性法、型特异性探针杂交法、基因芯片法等［9］。Sanger 测序法作为检测HCV 基因分型的推荐方法［3］，是HCV 基因分型的“金标准”。本研究通过巢式PCR 扩增有代表性的基因片段CORE/E1 区，使用测序仪对核苷酸序列测定后，与GenBank 中已上传的基因型进行序列比对，使用相关软件进行HCV 基因系统进化树分析，检出多种常见丙肝基因型和基因亚型，并发现新的基因型和基因亚型。在纳入本研究的148 例丙肝抗体阳性患者样本中，Sanger 测序法检出率为100%，且检出了1g 型和6xa 型2 种未在本地区中报道过的基因亚型［10］。尽管测序法可精准地检出HCV 各基因亚型及突变，但其检测周期长，流程复杂，对实验室设备、操作人员要求较高，难以在临床中广泛推广。

我国医疗机构多采用PCR-荧光探针法、PCR-反向点杂交法对大规模样本进行丙肝基因分型的测定［11-12］，与Sanger 测序法相比，PCR-荧光探针法操作简单、快速，本研究中PCR-荧光探针法检出率为91.89%，与Sanger 测序法比较检出率无统计学差异，且一致性较高。使用PCR-反向点杂交法检出率为91.22%，与Sanger 测序法比较检出率无统计学差异，且一致性较高。相比PCR-荧光探针法，PCR-反向点杂交法增加了杂交和显色的步骤，检测周期略长，但可检出1b 型、2a 型、3a 型、3b 型、6a型5 种常见的亚型以及1b/2a 型、1b/3b 型、1b/6a 型3 种混合型阳性样本，能较全面地检测出常见的HCV 基因亚型，能够满足现阶段临床常规诊疗需要。相对其他两种方法，Sanger 测序法对于非常规基因亚型的检测更有优势，但本研究样本均来自于同一地区，数量有限，且本地区人口流动性相对较小，因此无法广泛地涵盖多种HCV 基因亚型，可能对结果造成一定的影响。针对不同检测方法检出率和一致性的比较和分析，需进一步增加样本数量以期获得更为全面和准确的结论。

针对不同基因亚型的患者制定差异化、个性化的治疗方案，可有效地降低HCV 相关肝硬化以及肝细胞癌的发生率和死亡率。PCR-荧光探针法、PCR-反向点杂交法与测序法相比一致性高，且对实验室设备、技术人员水平要求低，操作简单，检测周期短，适合基层医疗机构推广使用。当其他方法无法检出或检测结果不明确时，建议结合临床需要，使用Sanger 测序法对其他丙肝基因分型方法进行补充，以期满足临床诊疗需求。