miR-195 在孕产妇下肢深静脉血栓患者外周血中的表达及其临床意义

闫莉丽 杨涛 张春梅 张桂欣

下肢深静脉血栓（deep vein thrombosis，DVT）主要表现为血液异常凝结在下肢深静脉内，造成管腔堵塞，进一步引发静脉回流障碍。DVT 的发生率逐年呈不断上升趋势，而孕产妇女性因妊娠疾病、子宫压迫、激素水平等因素导致其成为DVT的高发人群，孕产妇DVT 的发生率是健康成年女性的4～5 倍［1］。孕产妇DVT 的形成使孕产妇及胎儿并发症的发生风险进一步提高，不仅能并发大出血、肺栓塞、坏疽等严重并发症，甚至还威胁孕产妇及胎儿的生命健康。因此，早期诊治DVT 可降低该疾病带来的危害，对病死率的降低均有积极意义。目前，诊断DVT 的“金标准”是静脉造影，但其为有创操作，不适用于孕产妇群体。因而亟需寻找一种敏感性、特异性高且为无创的临床诊断标志物。有研究显示［2］，与健康对照相比，静脉栓塞患者的外周血中微小核糖核酸（microRNA，miRNA）表达具有显著差异。TANG 等［3］也表示miRNA 对DVT 具有一定的促进作用，并可调控转录后基因，对维持机体内的稳定状态具有重要意义。有研究报道［4］，miR-195 可抑制血管形成以及细胞增殖。因此，本研究通过检测miR-195 在孕产妇DVT 患者的表达水平，分析其与与临床病理参数和预后的相关性，旨在证实血清miR-195 成为孕产妇DVT 患者早期诊断指标和预后判断分子的潜力。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017 年1 月至2019 年12 月在唐山市妇幼保健院产检并分娩的116 例孕产妇DVT 患者为DVT 组，纳入标准：①所有患者均在产后1 周经下肢静脉造影确诊，且均符合《深静脉血栓形成的诊断和治疗指南》［5］中DVT 的诊断标准；②认知及沟通正常，可配合研究；③患者或家属知情并签署知情同意书。排除标准：①孕前诊断为DVT；②合并下肢感染或存在外伤；③合并易栓症、凝血功能障碍及血液系统疾病；④近14 d 服用抗凝药物者；⑤异常妊娠者。另选择同期109 例产检并分娩且未发生DVT 的孕产妇为非DVT 组，均在产后1 周经下肢静脉造影确认为未发生DVT。

1.2 方法

1.2.1 标本收集及检测

使用一次性真空采血管采集所有研究对象的空腹外周静脉血5 mL，3 000 r/min 离心10 min，离心半径为10 cm，分离后取上清液，置于-80℃存放，待测。①miR-195：采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测miR-195 的表达量。取外周血样本采用miRNeasy Serum/Plasma Kit（大连TAKARA）进行总RNA 的提取，取2 μL RNA 为模板，按照SuperScript RT kit（大连TAKARA）说明书进行逆转录反应以及荧光定量PCR 反应。miR-195 引物序列（F：5-GTATTCGCACTGGATACGACC-GACC-3'，R：5'-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3'）。每个样品的CT 值以U6 为内参，得到平均循环阈值（Ct 值），用2-ΔΔCt计算miR-195 相对表达量。②D-二 聚体（D-Dimer，D-D）、凝血功能指标检测：采用XT-1800i 全自动血液分析仪（日本SYSMEX 公司）及其对应试剂盒检测所有研究对象的D-D、凝血功能相关指标［纤维蛋白原（fibrinogen，Fib）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、部分活化凝血酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、国际标准化比值（international normalized ratio，INR）］。③红细胞计数：采用HA-360 型全自动血细胞分析仪（艾康生物技术）及其对应试剂盒检测所有研究对象的红细胞计数。以上操作均由经过培训的检验科人员严格按照试剂盒说明书完成。

1.2.2 资料收集

查阅病历资料获取所有研究对象的临床资料，包括研究对象的年龄、体质量指数（Body mass index，BMI）、妊娠合并症（妊娠期高血压、糖尿病等）、孕产次、分娩方式、产褥期卧床时间、产后出血等临床资料。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件分析处理数据，计数资料用n（%）表示，组间比较行卡方检验；计量资料用（±s）表示，两组间比较行独立样本t检验。Pearson 分析miR-195 与DD、红细胞计数、Fib、PT、APTT、INR 的相关性；Logistic 回归分析孕产妇并发DVT 的独立影响因素；受试者工作曲线（ROC）评估miR-195 对孕产妇并发DVT 的诊断价值。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料比较

两组年龄、BMI、分娩方式、产后出血、妊娠合并症、产褥期卧床时间、miR-195、DD、Fib、PT、APTT 等比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组患儿的临床资料比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data of children in two groups［n（%），（±s）］

表1 两组患儿的临床资料比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data of children in two groups［n（%），（±s）］

2.2 孕产妇并发DVT 的多因素Logistic 回归分析

以孕产妇是否发生DVT 为因变量，将上述具有统计学意义的因素为自变量纳入Logistic 回归模型。结果显示，年龄、BMI、分娩方式、产后出血、妊娠合并症、产褥期卧床时间、miR-195、DD、Fib、PT、APTT 均与孕产妇并发DVT 的独立有关（P＜0.05）。见表2。

表2 孕产妇并发DVT 的多因素Logistic 回归分析Table 2 Multifactorial logistic regression analysis of maternal complications of DVT

2.5 miR-195 对孕产妇并发DVT 的诊断价值

ROC 曲线显示，miR-195 诊断孕产妇并发DVT的AUC 为0.952（95%CI：0.904～0.989），最佳截断值敏为1.56，敏感度0.948、特异度0.908（P＜0.05）。

2.2 miR-195 与DD、红细胞计数、Fib、PT、APTT、INR 的相关性分析

Pearson 相关分析显示，miR-195 与DD、红细胞计数Fib 呈正相关，与PT、APTT 呈负相关（P＜0.05）。见表3。

表3 miR-195 与DD、红细胞计数、Fib、PT、APTT、INR 的相关性分析Table 3 Correlation analysis of miR-195 with DD，erythrocyte count，Fib，PT，APTT，and INR

3 讨论

孕产妇女性处于特殊生理期，血液中的促凝、抗凝等物质以及纤溶活性会发生改变，特别是孕晚期时变化更显著，使孕产妇呈现高凝状态，容易诱发DVT［6］。DVT 一旦形成，使孕产妇的生活质量、身心健康受到严重影响，而且脱落后容易发生肺动脉栓塞，严重威胁孕产妇的生命。因此，早期预测及诊断孕产妇DVT 的具有重要的临床意义。本研究结果提示miR-195 及相关高凝状态在DVT的发病过程中具有重要作用。本研究进一步Logistic 回归分析证实，miR-195、DD、Fib、APTT、PT 与孕产妇并发DVT 的密切相关。凝血功能指标是有效反映人体血液凝集状态，常用的指标Fib、APTT、PT 等，这些凝血功能指标常在妊娠期、产褥期等均会发生显著变化，能为孕产妇DVT 的发生提供临床参考，丁光伟等［7］表示当PT 水平下降时提示患者的血液呈现出高凝状态并逐步加重；Nykanen 等［8］研究表明APTT 和PT 水平下降，FIB 升高时提示随着病情的加重，患者的血管内凝血会加剧消耗。然而，因孕产妇的临床表现比较复杂且并发症的发生也较多，凝血功能指标的检测对于孕产妇DVT 的诊断具有一定的局限性。DD 是纤维蛋白原降解形成的一种特异性产物，是反映机体凝血功能、血栓溶解及血栓形式重要指标，也是临床诊断DVT 最常用的生物指标。张茜等［9］研究表示与非DVT 患者比较，DVT 患者的血清DD 水平异常升高，且曲线下面积为0.893，提示DD 水平与DVT 疾病存在着密切的联系。而孕产妇在妊娠与分娩等因素的作用下，会出现高凝状态，加之分娩时会产生一定的应激反应，因此孕产妇的DD 水平会高于其他人群，故依据DD 水平不能作为诊断孕产妇DVT 的依据。miRNA 已广泛参与生理调节以及多种细胞、组织中的病理过程，且涉及到细胞增殖、分化、凋亡及机体器官、组织的发育，其与肿瘤、心血管疾病的发生及发展密切相关［10］。Jin等［11］研究发现血管内皮细胞凋亡是形成DVT 形成的关键因素，miR-195 在DVT 患者血液中的显著升高，而miR-195 降低能促进细胞活力及细胞代谢，进而抑制血管内皮细胞凋亡，当miR-195 升高则可参与血管内皮细胞凋亡，逐步形成DVT，可作为DVT 的治疗靶点。Srivastava 等［12］研究也发现miR-195 在DVT 的诊断中具有重要价值。本研究ROC 结果证实，miR-195 诊断孕产妇并发DVT 的AUC 为0.952，表示该指标的诊断效能好，具有较高的临床价值。本研究相关性提示通过检测外周血miR-195 水平不仅可为孕产妇DVT 的发生提供量化参考，亦可作为评估DVT 病情的重要参考指标。

此外，本研究还显示，年龄、BMI、剖宫产、产后出血、妊娠合并症、产褥期卧床时间均是孕产妇并发DVT 的独立影响因素，提示可根据以上影响采取对应措施降低孕产妇DVT 的形成。临床研究发现［13］，年龄＞35 岁高龄孕产妇会提高相关并发症的发生情况，因年龄的增长，机体功能逐渐减退，下肢血回流、静脉瓣及心功能逐渐衰弱，加之妊娠期激素水平的变化，血液黏稠度会增加，进一步增加DVT 的发生风险。BMI 越大的患者其血液黏稠度越高，血栓形成风险随之增加。产褥期卧床时间、产后出血均会增加DVT 的发生，故应予以针对性护理干预预防血栓的形成，并鼓励孕产妇早下床活动，缩短卧床时间，促进静脉血流，降低高凝状态的发生［14］。分娩方式为剖宫产DVT 的发生风险显著高于自然顺产的产妇，与Swartz 等［15］研究报道一致，可能因剖宫产因术中的麻醉药物及创伤等因素导致静脉平滑肌舒张、血管内皮细胞损伤，且术后产后出血及需要卧床休息等，增加下肢静脉血液回流的难度，进而诱发血栓的形成。妊娠合并症可影响孕产妇的血流动力学，导致代谢稳乱，且存在妊娠合并症的孕产妇多应用剖宫产来终止妊娠，故DVT 的发生风险会增高［16］。

综上所述，孕产妇DVT 患者中的miR-195 水平显著升高，且对孕产妇DVT 的发生具有较高的诊断效能，可为临床诊断DVT 提供参考，具有重要的临床意义。